この方法の目的は、脳スライスにおける光刺激を用いて、遠くの脳領域からの長距離入力の機能的な結合性を同定することである。光感受性イオンチャネルの様々な媒介発現のための特定の脳領域の立体的標的化は、光でその領域から来る軸索の選択的刺激を可能にする。この手順をデモンストレーションすることは、私のグループの博士課程の学生、ルイ・リシュヴォーです。
手術前に、動物がつま先ピンチで十分に麻酔されていることを確認してください。呼吸を容易にするために舌をそっと引き出す。次に、頭蓋毛を剃ります。
局所麻酔のために頭の皮膚の下に塩酸リドカインの20マイクロリットルを注入し、5分待ちます。頭蓋骨を露出するには、頭皮に切り傷を付けます。次に、動物を立体的なフレームに入れる。
イヤーバーを挿入し、耳にわずかにrostral骨の上にそれらを休ませ、頭蓋骨への良好なアクセスを作成するために皮膚を引き下げます。イヤーバーを締めて、鼻の部分を取り付けます。高さ調節されたサポートを使用して、動物の体を水平に、そして頭部のレベルで維持する。
動物の下に加熱パッドを置き、生理学的温度に保ちます。その後、軟部組織を除去するために綿棒で0.9%塩化ナトリウムを適用することによって頭蓋骨をきれいにします。ブレグマラムダアクセスが平準化されるように頭蓋骨を調整します。
次に、後部および内側の座標に従って頭蓋骨上の注射部位を見つけ、その上に注射針を置く。使い捨て針で頭蓋骨をマークします。続いて注射針を4センチ上に動かします。
0.5ミリのバリを使用して、最高速度の半分でマークに直径1ミリメートルの開頭術を作成します。出血が起こった場合、組織で綿棒。次に、ハミルトンの注射器に含まれる水を空にして、ポンプで完全に排出して保管します。
針だけが水で満たされています。氷上に注入されるウイルス溶液を解凍し、その後、氷から簡単に除去し、マイクロピペットで溶液の700ナノリットルを得る。次に、パラフィンフィルムの一部に滴を堆積する。
パラフィンフィルムを頭蓋骨切り出しの上に置きます。前部および横方向の位置を変えずに、ウイルス溶液の滴に針を突き落とす。その後、ポンプの引き出し機能を使用して、パラフィンフィルム上の約500ナノリットルのウイルス溶液をシリンジに充填する。
ステレオスコープの下でこの手順を実行し、落下が消えるのを見て、空気を吸引しないようにしてください。注射器が正しく充填されていることを確認します。プランジャーを下ろして、液体の小さな滴を排出テストして、排出システムをテストします。
その後、選択した深さに脳に針を挿入します。インジェクションの実行ボタンを押します。その後、3〜5分以上ゆっくりと針を引き出します。
目詰まりを避けるために、数回空に充填することによって、すぐにきれいな蒸留水で針を洗います。その後、ステレオタキシックフレームから動物を取り除きます。皮膚を縫合し、2-1-1標準外科結び目で結ばれた3つまたは4つのステッチを作ります。
脳を抽出するには、首から鼻まで皮膚を切り取り、頭蓋骨から最後の椎骨をはさみで切り離します。皮膚を引き込み、正中線から鼻の方向に頭蓋骨をカットします。頭頂骨と前頭骨の尾骨部分を慎重に取り除きます。
脳と頭蓋床の間に挿入し、嗅球、視神経、その他の脳神経や小脳を切り離すことによって、小さな丸みを帯びたへらで脳を抽出します。氷冷切断液で脳を穏やかに沈めます。その後、脳を濾紙に移し、皮質表面を静かに乾燥させます。
水平脳スライスをカットするために、ブレードに面した尾骨側を持つビブラートームの標本ホルダーに脳皮質を接着します。次に、脳が完全に沈み込むように、氷冷酸素切断溶液で切断室を満たします。1ミリメートルの振幅で毎秒07ミリメートルの速度でビブラードームとのセクション300マイクロメートル厚いスライス。
この段階では、蛍光懐中電灯とそれに対応するフィルターグラスを使用して視床のクロノス-GFP発現を簡単に確認することをお勧めします。全細胞パッチクランプ記録を行うために、海馬複合体を含む脳スライスを記録チャンバーに静かに移す。連続して34°C ACSFで録音チャンバーを1分あたり2〜3ミリリットルでカルボーゲンで泡立てる浸透。
関心領域の軸索端子におけるクロノス-GFPの発現を、4倍の青色のLED照明で簡単に調べます。63倍の浸漬目標に変更し、フォーカスを調整します。クロノス-GFPを表現する軸索を確認し、パッチ記録用のピラミッド型ニューロンを選択します。
次に、ピペットにグルコン酸カリウムベースの内部溶液を充填します。ヘッドステージのピペットホルダーに取り付けます。電圧クランプ構成でセルにパッチを当てる。
特定されたニューロンにアプローチし、繊細にソーマにピペットの先端を押します.正圧は膜表面にディンプルを生じるはずです。次に、圧力を解放してgigoOmシールを作成します。
密封したら、保持電圧をマイナス65ミリボルトに設定します。負圧の鋭いパルスで膜を壊します。全細胞電流クランプモードで過分極および脱分極電流ステップに対するニューロンの応答を記録します。
クロノスを発現する発泡繊維の475ナノメートルLED全野原刺激に対する電流または電圧クランプポストナプティクス応答で記録します。20ヘルツで2ミリ秒の持続時間の10の刺激の列車で刺激します。超分極および脱分極電流ステップに応答した層3におけるサブラーニューロンの活性を、全細胞パッチクランプ構成に記録した。
クロノス-GFPを発現する刺激ADN軸索末端は、現在のクランプモードにおけるサブラー層3主細胞における興奮性シナプス後電位を引き出した。光の強度に応じて、Epsはアクションの潜在的なしきい値に達する可能性があります。興奮性シナプス後電流が引き出されたように、ポストシナプス応答は電圧クランプモードでも観察された。
ここに示されているのは、表皮顕微鏡で画像化されたDAPI染色を用いたサブ濾過前の表面層でクロノスGFPを発現する視床軸索に囲まれた3つの錐体ニューロンである。そして、この画像は、共焦点顕微鏡でより高い倍率で撮影されました。蛍光トレーサによるパイロット実験を行う際には、軸に沿ったブレグマの慎重なレベリングは、立体的注入の精度を向上させるために重要です。
この手順は、2つの異なる波長に敏感な2つの生成シーンに注入することによって、異なる領域からの収束投影を調査するためにも使用できます。この技術の開発により、細胞型特有の方法で遠くの脳領域間の正確な解剖学的および機能的回路解析が可能になった。
