O objetivo deste método é identificar a conectividade funcional de entradas de longo alcance de regiões cerebrais distantes usando fotostimulação em fatias cerebrais. O direcionamento estereotipado de uma região cerebral específica para várias expressões mediadas de canais de íons sensíveis à luz permite a estimulação seletiva de axônios provenientes daquela região com luz. Demonstrando o procedimento estará Louis Richevaux, um estudante de doutorado do meu grupo.
Antes da cirurgia, verifique se o animal está bem anestesiado com uma pitada de dedo do pé. Puxe suavemente a língua para facilitar a respiração. Então, raspe o cabelo craniano.
Injete 20 microlitres de cloridrato de lidocaína sob a pele da cabeça para anestesia local e espere cinco minutos. Para expor o crânio, faça um corte no couro cabeludo. Em seguida, coloque o animal em uma moldura estereotaxa.
Insira as barras de ouvido e coloque-as sobre os ossos ligeiramente rostral para as orelhas e puxe a pele para criar um bom acesso ao crânio. Aperte as barras de ouvido e instale a peça do nariz. Mantenha o corpo do animal horizontalmente e ao nível da cabeça usando um suporte ajustado à altura.
Coloque uma almofada de aquecimento sob o animal para mantê-la em temperatura fisiológica. Em seguida, limpe o crânio aplicando 0,9% de cloreto de sódio com um cotonete para remover tecido mole. Ajuste o crânio para que o acesso bregma lambda seja nivelado.
Em seguida, localize o local de injeção no crânio de acordo com as coordenadas posteriores e medial e posicione a agulha de injeção acima dele. Marque o crânio com uma agulha descartável. Posteriormente, mova a agulha de injeção para cima por quatro centímetros.
Usando uma rebarba de 0,5 milímetros, crie uma craniotomia de um milímetro de diâmetro na marca a metade da velocidade máxima. Cotonete com um tecido se ocorrer algum sangramento. Em seguida, esvazie a água contida na seringa Hamilton para armazenamento, ejetando-a completamente com uma bomba.
Só a agulha está cheia de água. Descongele a solução viral a ser injetada no gelo, então, remova-a brevemente do gelo e obtenha 700 nanoliters da solução com uma micropipette. Em seguida, deposite uma gota em um pedaço de filme de parafina.
Coloque o filme de parafina em cima da craniotomia. Mergulhe a agulha na gota de solução viral sem alterar o anteroposterior e a posição lateral. Depois, use a função de retirada da bomba para encher a seringa com cerca de 500 nanoliters da solução viral no filme de parafina.
Realize este procedimento sob o estereoscópio, observe a queda desaparecendo e certifique-se de não aspirar nenhum ar. Certifique-se de que a seringa foi preenchida corretamente. Teste o sistema de ejeção dirigindo pelo êmbolo para testar uma pequena gota de líquido.
Posteriormente, insira a agulha no cérebro até a profundidade escolhida. Pressione o botão de execução para injeção. Em seguida, retire lentamente a agulha por três a cinco minutos.
Lave imediatamente a agulha em água limpa destilada, preenchendo-a várias vezes, a fim de evitar entupimento. Depois, remova o animal do quadro estereotaxico. Sutura a pele e faça três ou quatro pontos amarrados com nós cirúrgicos padrão 2-1-1.
Para extrair o cérebro, faça um corte na pele do pescoço ao nariz, em seguida, seque as últimas vértebras do crânio com uma tesoura. Retraia a pele e corte o crânio ao longo da linha média da direção caudal para rostral. Remova cuidadosamente o osso parietal e a parte caudal do osso frontal.
Extrair o cérebro com uma pequena espátula arredondada inserindo-o entre o cérebro e o piso craniano, seccionando a lâmpada olfativa, nervo óptico e outros nervos cranianos e cerebelo. Submergir suavemente o cérebro em solução de corte gelado. Posteriormente, transfira o cérebro para um papel filtro e seque suavemente a superfície cortical.
Cole o córtex cerebral no suporte do espécime de um vibratome com o lado caudal voltado para a lâmina, a fim de cortar fatias horizontais cerebrais. Em seguida, encha a câmara de corte com solução de corte oxigenado gelado para que o cérebro seja totalmente im fundido. Seção 300 mímetros de espessura fatias com o vibratome a uma velocidade de 07 milímetros por segundo a uma amplitude milimétrica.
Nesta fase, recomenda-se verificar brevemente a expressão Cronos-GFP no tálamo usando uma lanterna fluorescente e óculos de filtro correspondentes. Para realizar a gravação de grampos de células inteiras, transfira suavemente uma fatia cerebral contendo o complexo hipocampal para a câmara de gravação. Perfunda continuamente a câmara de gravação com 34 graus Celsius ACSF borbulhado com carbogen a dois a três mililitros por minuto.
Examine brevemente a expressão Chronos-GFP em terminais de axônio na região de interesse com iluminação LED azul na ampliação 4X. Mude para um objetivo de imersão 63X e ajuste o foco. Verifique se há axônios expressando Chronos-GFP e escolha um neurônio piramim para gravação de patches.
Em seguida, encha uma pipeta com solução interna baseada em gluconato de potássio. Monte-o no suporte de pipeta no palco da cabeça. Remende a célula na configuração do grampo de tensão.
Aproxime-se do neurônio identificado e pressione delicadamente a ponta da pipeta sobre a soma. A pressão positiva deve produzir uma covinha na superfície da membrana. Em seguida, libere a pressão para criar um selo gigoOm.
Uma vez selado, coloque a tensão de retenção em menos 65 milvolts. Quebre a membrana com um pulso acentuado de pressão negativa. Registo as respostas do neurônio à hiperpolarização e despolarização das etapas atuais no modo de fixação de corrente de células inteiras.
Registro em respostas pós-sinápticas de grampo de corrente ou tensão a 475 nanômetros led estimulação de campo inteiro de fibras aferentes expressando Cronos. Estimule com trens de dez estímulos de dois milissegundos de duração a 20 hertz. A atividade dos neurônios pré-ubiculares na camada três em resposta à hiperpolarização e despolarização das etapas atuais foi registrada na configuração de grampo de remendo de células inteiras.
Estimular os terminais de axônio ADN expressando cronos-GFP provocou potenciais pós-sinápticos excitatórios na camada pré-ubicular três células principais no modo de fixação atual. Dependendo da intensidade da luz, os EPSPs podem atingir o limiar potencial de ação. Respostas pós-sinápticas também foram observadas no modo de fixação de tensão, à medida que as correntes pós-sinápticas excitatórias foram provocadas.
Mostrado aqui é uma camada três neurônios piramimatais cercados por axônios talâmicos expressando Cronos-GFP em camadas superficiais pré-ubiculares com coloração DAPI imagem com um microscópio de epifluorescência. E esta imagem foi tirada em uma ampliação mais alta com um microscópio confocal. Um nivelamento cuidadoso da bregma ao longo do eixo na realização de experimentos piloto com um rastreador fluorescente são cruciais para melhorar a precisão da injeção estereotaxic.
Este procedimento também pode ser usado para investigar projeções convergentes de diferentes áreas, injetando em duas cenas generativas sensíveis a dois comprimentos de onda diferentes. O desenvolvimento desta técnica permitiu uma análise precisa de circuitos anatômicos e funcionais entre regiões cerebrais distantes de forma específica do tipo celular.
