이 방법의 목적은 뇌 슬라이스의 사진 자극을 사용하여 먼 뇌 영역에서 장거리 입력의 기능적 연결을 식별하는 것입니다. 빛에 민감한 이온 채널의 다양한 매개 표현에 대한 특정 뇌 영역의 스테레오 탁스 타겟팅은 빛과 그 지역에서 오는 축축의 선택적 자극을 허용한다. 절차를 시연하는 것은 내 그룹에서 박사 과정 학생 인 루이 리체보 (Louis Richevaux)가 될 것입니다.
수술 전에 동물이 발가락 핀치로 잘 마취되었는지 확인하십시오. 부드럽게 호흡을 용이하게하기 위해 혀를 당깁니다. 그런 다음 두개골 머리를 면도합니다.
리도카인 염산염 20마이크로리터를 머리 껍질 밑에 주입하여 국소 마취를 하고 5분간 기다립니다. 두개골을 노출하려면 두피에 상처를 줄수 있습니다. 그런 다음 동물을 스테레오테틱 프레임에 놓습니다.
이어 바를 삽입하고 뼈에 약간 장밋빛으로 귀를 놓고 피부를 아래로 당겨 두개골에 대한 좋은 접근을 만듭니다. 이어 바를 조이고 코 조각을 설치합니다. 높이 조절 된 지원을 사용하여 동물의 몸을 수평 및 머리 수준에서 유지합니다.
동물 아래에 가열 패드를 놓고 생리학적 온도에서 유지합니다. 그런 다음 연조직을 제거하기 위해 면봉으로 염화 나트륨 0.9 %를 적용하여 두개골을 청소하십시오. 두개골을 조정하여 브레그마 람다 접근이 평준화되도록 합니다.
이어서, 후방 좌표에 따라 두개골상에 주사 부위를 찾아 내고 주사 바늘을 위에 배치한다. 일회용 바늘로 두개골을 표시합니다. 그 후, 사출 바늘을 4센티미터 위로 이동합니다.
0.5 밀리미터 버를 사용하여 최대 속도의 절반에 마크에 1 밀리미터 직경의 두개골 절제술을 생성합니다. 출혈이 발생하면 조직과 면봉. 다음으로, 펌프로 완전히 배출하여 보관을 위해 해밀턴 주사기에 들어있는 물을 비웁다.
바늘만 물로 채워져 있습니다. 얼음에 주입할 바이러스 성 용액을 해동한 다음 얼음에서 잠시 제거하고 마이크로 파이프로 용액700 나노 리터를 얻습니다. 다음으로 파라핀 필름 한 조각에 한 방울을 입금합니다.
파라핀 필름을 두개골 절제술 위에 놓습니다. 전방 및 측면 위치를 변경하지 않고 바이러스 성 용액의 드롭에 바늘을 급락. 그 후, 파라핀 필름에 바이러스 용액의 약 500 나노리터로 주사기를 채우기 위해 펌프의 인출 기능을 사용한다.
스테레오스코프 아래에서 이 절차를 수행하고, 드롭이 사라지는 것을 지켜보고, 공기를 흡인하지 않도록 하십시오. 주사기가 올바르게 채워졌는지 확인합니다. 플런저를 운전하여 배출 시스템을 테스트하여 작은 액체 방울을 배출하는 테스트를 테스트합니다.
그 후, 선택한 깊이에 뇌에 바늘을 삽입. 실행을 눌러 주입합니다. 그런 다음 3~5분 동안 바늘을 천천히 철회합니다.
막히지 않도록 여러 번 비우기 위해 바늘을 깨끗한 증류수로 즉시 씻으실 수 있습니다. 그 후, 스테레오 탁스 프레임에서 동물을 제거합니다. 피부를 봉합하고 2-1-1 표준 수술 노트로 묶여 서너 바늘을 합니다.
뇌를 추출하려면 목에서 코로 피부를 잘라낸 다음 두개골에서 마지막 척추를 가위로 절제합니다. 피부를 철회하고 중선을 따라 두개골을 코달에서 장밋빛 방향으로 자른다. 정수리 뼈와 전두엽 뼈의 caudal 부분을 조심스럽게 제거하십시오.
뇌와 두개골 바닥 사이에 삽입하여 작은 둥근 주걱으로 뇌를 추출하여 후각 전구, 시신경 및 기타 두개골 신경과 소뇌를 단면화하십시오. 얼음 냉기 절삭 용액에 뇌를 부드럽게 담급합니다. 그 후 뇌를 필터 용지로 옮기고 피질 표면을 부드럽게 건조시다.
수평 뇌 조각을 잘라내기 위해 칼날을 향한 카우달 측과 함께 뇌 피질을 진동체의 표본 홀더에 붙입니다. 다음으로, 뇌가 완전히 침수되도록 얼음 차가운 산소 절단 용액절단 으로 절단 챔버를 채웁니다. 1mm 진폭에서 초당 07밀리미터의 속도로 진동과 함께 300 마이크로미터 두께의 슬라이스.
이 단계에서는 형광 손전등 및 해당 필터 안경을 사용하여 시상에서 크로노스-GFP 발현을 간략하게 확인하는 것이 좋습니다. 전세포 패치 클램프 레코딩을 수행하려면 해마 복합체를 함유한 뇌 슬라이스를 녹음실로 부드럽게 전달합니다. 분당 2~3밀리리터에서 카보겐으로 거품을 낸 ACSF 는 섭씨 34도로 기록챔버를 지속적으로 견딜 수 있습니다.
4배 배율에서 파란색 LED 조명을 사용하는 익슨 단자에서 크로노스-GFP 발현을 간략하게 검사합니다. 63X 몰입 도면 목표로 변경하고 초점을 조정합니다. 크로노스-GFP를 표현하는 축축을 확인하고 패치 녹화를 위해 피라미드 뉴런을 선택하십시오.
다음으로, 칼륨 글루코네이트 기반의 내부 용액으로 파이펫을 채웁니다. 헤드 스테이지의 파이펫 홀더에 장착합니다. 전압 클램프 구성에 셀을 패치합니다.
확인된 뉴런에 접근하고 피펫 끝을 소마에 섬세하게 누릅니다. 양압은 멤브레인 표면에 보조를 생성해야합니다. 그런 다음 압력을 해제하여 gigoOm 씰을 만듭니다.
밀봉되면 보유 전압을 마이너스 65밀리볼트로 설정합니다. 음압의 날카로운 펄스로 멤브레인을 깰. 전세포 전류 클램프 모드에서 전류 단계의 극화 및 탈극화에 대한 뉴런의 반응을 기록합니다.
크로노스를 발현하는 포퍼런트 섬유의 475나노미터 LED 전필드 자극에 대한 전류 또는 전압 클램프 포스트냅틱 응답기록을 기록한다. 20 헤르츠에서 2 밀리 초 기간의 10 자극의 열차로 자극. 과극화 및 탈극화 전류 단계에 대한 응답으로 3층에서 전수체 뉴런의 활성은 전세포 패치 클램프 구성에 기록되었다.
크로노스-GFP를 발현하는 ADN 축삭 단자 자극은 현재 클램프 모드에서 3개의 주체 세포에서 사전 시냅스 후 전위잠재력을 유도하였다. 광 강도에 따라 EPSP는 작업 잠재적 임계값에 도달할 수 있습니다. 시냅스 후 전류가 유도됨에 따라 전압 클램프 모드에서도 시냅스 후 응답이 관찰되었다.
여기에 나타난 3층 피라미드형 뉴런은 극치의 현미경으로 이미지된 DAPI 염색을 통해 전수체 피상층에서 크로노스-GFP를 발현하는 탈라믹 축소로 둘러싸여 있다. 그리고이 이미지는 공초점 현미경으로 더 높은 배율에서 촬영되었다. 형광 추적기로 파일럿 실험을 수행하는 축을 따라 bregma를 신중하게 평준화하는 것은 스테레오탁스 주입의 정밀도를 향상시키는 데 중요합니다.
이 절차는 또한 두 개의 서로 다른 파장에 민감한 두 개의 생성 장면에서 주입하여 다른 영역에서 수렴 투영을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 발달은 세포 모형 특정 방식으로 먼 두뇌 지구 사이 정확한 해부학 및 기능회로 분석을 허용했습니다.
