Целью данного метода является выявление функциональной связи дальних входных данных из отдаленных областей мозга с использованием фотостимуляции в срезах мозга. Стереотаксис ориентации конкретной области мозга для различных опосредованное выражение светочувствительных ионных каналов позволяет селективной стимуляции аксонов, поступающих из этой области со светом. Демонстрация процедуры будет Луи Richevaux, аспирант из моей группы.
Перед операцией убедитесь, что животное хорошо обезболено с щепоткой ноца. Аккуратно вытащите язык, чтобы облегчить дыхание. Затем побрить черепные волосы.
Введать 20 микролитров лидокаина гидрохлорида под кожу головы для местной анестезии и ждать пять минут. Чтобы разоблачить череп, сделайте разрез на коже головы. Затем поместите животное в стереотаксис.
Вставьте ушные батончики и покойте их на костях слегка ростральными к ушам и потяните вниз кожу, чтобы создать хороший доступ к черепу. Затяните ушные прутья и установите кусок носа. Поддерживайте тело животного горизонтально и на уровне головы с помощью поддержки с поправкой на высоту.
Поместите грелку под животное, чтобы держать его при физиологической температуре. Затем очистите череп, применив 0,9% хлорида натрия с помощью ватного тампона для удаления мягких тканей. Отрегулируйте череп так, чтобы доступ к брегме лямбды выровнялся.
Затем, найти место инъекции на черепе в соответствии с задней и медиальной координаты и положение инъекции иглы над ним. Отметь череп одноразовой иглой. Впоследствии переместит инъекцию иглы вверх на четыре сантиметра.
Используя заусенцев диаметром 0,5 миллиметра, создайте краниотомию диаметром один миллиметр на отметке на половину максимальной скорости. Шваб с тканью, если есть кровотечение происходит. Затем опорожните воду, содержащуюся в шприце Гамильтона для хранения, полностью выбросив ее с помощью насоса.
Только игла наполнена водой. Оттепель вирусного раствора, который будет вводиться на льду, затем, кратко удалить его из льда и получить 700 нанолитров раствора с микропипютой. Далее, депозит капли на кусок парафина пленки.
Поместите парафиновую пленку поверх краниотомии. Окунитесь иглы в каплю вирусного раствора, не изменяя антеропостер и боковое положение. После этого используйте функцию снятия насоса, чтобы заполнить шприц около 500 нанолитров вирусного раствора на парафиновой пленке.
Выполните эту процедуру под стереоскопом, наблюдайте, как капля исчезает, и убедитесь, что не аспирировать любой воздух. Убедитесь, что шприц был заполнен правильно. Проверьте систему выброса, съезжев с поршеня, чтобы проверить выброс небольшой капли жидкости.
Впоследствии вставьте иглу в мозг на выбранную глубину. Нажмите кнопку запуска для инъекций. Затем медленно свямите иглу в течение трех-пяти минут.
Немедленно вымойте иглу в чистой дистиллированной воде, заполнив опорожнив ее несколько раз, чтобы избежать засорения. После этого удалите животное из стереотаксиаической рамы. Шов кожи и сделать три или четыре стежка связаны с 2-1-1 стандартных хирургических узлов.
Чтобы извлечь мозг, сделать разрез на коже от шеи до носа, а затем раздел последних позвонков из черепа с ножницами. Увядите кожу и вырежьте череп вдоль средней линии от каудала до рострального направления. Аккуратно удалите теменной кости и хвостовой части лобной кости.
Извлекайте мозг с помощью небольшого округлого шпателя, вставив его между мозгом и черепным полом, разделив обонятельную лампу, зрительный нерв и другие черепные нервы и мозжечок. Аккуратно погрузите мозг в ледяной раствор для резки. Затем перенесите мозг на фильтровальную бумагу и аккуратно высушите корковую поверхность.
Приклейте кору головного мозга к держателю образца вибромы с хвостовой стороной, обращенной к лезвию, чтобы сократить горизонтальные ломтики мозга. Далее, заполнить режущей камеры с ледяной кислородом резки раствора, чтобы мозг полностью immerged. Раздел 300 микрометров толщиной ломтиками с вибромой со скоростью 07 миллиметров в секунду при одной миллиметровой амплитуде.
На этом этапе рекомендуется кратко проверить экспрессию Chronos-GFP в таламусе с помощью флуоресцентного фонарика и соответствующих очков фильтра. Для выполнения записи цельноклеточного патч-зажима, аккуратно перенесите ломтик мозга, содержащий комплекс гиппокампа, в камеру записи. Непрерывно пронизывая камеру записи с 34 градусами по Цельсию ACSF пузырились карбогеном на два-три миллилитров в минуту.
Кратко изучите экспрессию Chronos-GFP в аксон-терминалах в области интереса с синим светодиодным освещением при увеличении 4X. Измените цель погружения 63X и отрегулируйте фокус. Проверьте аксоны, выражаюющие Chronos-GFP, и выберите пирамидальный нейрон для записи патчей.
Затем заполните пипетки с глюконатом калия на основе внутреннего раствора. Умонтировать его в держатель пипетки на главной сцене. Патч ячейки в конфигурации зажима напряжения.
Подойди к идентифицированного нейрона и деликатно нажмите наконечник пипетки на сому. Положительное давление должно производить ямочки на поверхности мембраны. Затем отпустите давление, чтобы создать печать gigoOm.
После запечатыв, установите удерживаемое напряжение до минус 65 милливольт. Разбей мембрану резким пульсом отрицательного давления. Запись реакции нейрона на гиперполяризацию и деполяризацию текущих шагов в режиме зажима цельноклеточного тока.
Запись в текущем или напряжения зажима постсинаптических реакций на 475 нанометров светодиодных цельно-полевой стимуляции афферентных волокон, выражаюющих Chronos. Стимулировать с поездами из десяти стимуляций продолжительностью две миллисекунды на 20 герц. Активность предсубикулярных нейронов в слое 3 в ответ на гиперполяризацию и деполяризацию текущих шагов была зафиксирована в конфигурации цельноклеточного патч-зажима.
Стимулирование аксоновых терминалов ADN, выражаюющих Chronos-GFP, вызвало возбуждение пост-синаптических потенциалов в предсубикулярном слое трех основных ячеек в текущем режиме зажима. В зависимости от интенсивности света, EPSPs может достичь потенциального порога действия. Пост-синаптические реакции наблюдались также в режиме зажима напряжения, так как возбуждали пост-синаптические токи.
Здесь показан слой три пирамидальных нейрона, окруженный таламиными аксонами, выражают Chronos-GFP в предсубикулярных поверхностных слоях с окрашиванием DAPI, изображенным с помощью эпифлюоресцентного микроскопа. И это изображение было сделано при более высоком увеличении с помощью конфокального микроскопа. Тщательное выравнивание брегмы вдоль оси при проведении экспериментальных экспериментов с флуоресцентным трассировщиком имеет решающее значение для повышения точности стереотаксисной инъекции.
Эта процедура также может быть использована для исследования конвергентных проекций из разных областей путем введения на двух генеративных сцен чувствительны к двум различным длинам волн. Развитие этого метода позволило точно анатомического и функционального анализа цепи между отдаленными областями мозга в клеточном типе определенным образом.
