שיטה זו מודדת את רמות הרגולטור העולמי ppGpp בתוך תנאי צמיחה שונים ומצבי לחץ. PpGpp ניתן למצוא גרם חיידקים חיוביים ושליליים, כמו גם כלורופלסט. PpGpp יש התפרצות מהירה בשניות, אשר להוביל קשר שני מהיר פעם הלחץ מיוצר.
בו זמנית, יש לו זמן מחצית חיים קצר, עד 30 שניות. לכן, יש צורך לפקח על תרבות רבה במרווחי זמן שעשויים להשתנות מ 10 שניות לשעות, כולל מעברים לחוצים. אנחנו גם radiolabel תרבות חיידקים במנות microtiter מקל דגימות תפוקה גבוהה המאפשרים שכפולים טכניים וביולוגיים מרובים.
הקפד לפעול בהתאם לאמצעי הבטיחות המתאימים בעת עבודה עם חומרים רדיואקטיביים. כדי להתחיל בהליך זה, הכן את כל המדיה כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לגדול תרבויות לילה בתקשורת MOPS עם שלושה מילימולר נתרן פוספט.
הוסף 550 מיקרוליטרים של מדיה MOPS, רצף 0.2 נשא נתרן פוספט micromolar ו 30 microliters של כל inoculum חיידקים ל בארות של צלחת 24 גם. פעולה זו תגרום inoculum ראשוני עם OD600 של 0.1. הוסף מדיה טרייה למדיה אחת וכן בקרת סטריליות.
מניחים את הצלחת באינקובטור רועד ב 37 מעלות צלזיוס, רועד ב 900 סל"ד במשך 30 דקות. ניתן לפקח על הצמיחה באמצעות קורא לוחות עם לוחית משכפלת במקביל במדיה חסר p32 באמצעות קורא לוחות תוך דגירה באותם תנאים. לאחר מכן, להוסיף 100 microcuries של p32 אורתופוספט לכל באר של הצלחת.
לגדל את התרבויות באינקובטור רועד עבור אחד עד שניים הכפלות כדי לאפשר תווית חיצונית במידה רבה לצייד עם בריכות נוקלאוטידים בין תאיים. להדמיה נכונה, אף אחד מהחומר הפעיל לא היה בשימוש בסרטון זה. בניסוי אמיתי, נדרש מיגון נכון, כמו גם ניטור מתמיד לזיהום עם מד סקר.
ראשית, לגרום ללחץ באמצעות שיטה המתאימה לסוג של מתח למד. לאחר מכן, להוסיף 20 microliters של כל מדגם תא שכותרתו צינור PCR נפרד 0.2 מיליליטר, המכיל 20 microliters של קרח קר שש חומצה פורמית טוחן. מיד מניחים את הדגימות על קרח יבש.
שפר את יעילות החילוץ התאי בשלושה מחזורים של הקפאה והפשרה. רגע לפני התצפית PEI תאית כרומטוגרמות שכבה דקה, צנטריפוגה הדגימות במשך דקה אחת במהירות המרבית כדי גלולה פסולת התא. ראשית, להגדיר 20 על ידי 20 ס"מ PEI תאית צלחת TLC.
השתמש במספריים כדי להסיר את חמשת סנטימטרים העליונים. ולהשתמש בעיפרון רך כדי לסמן קו מקור סנטימטר אחד מהקצה. החל טיפה חמישה מיקרוליטר של כל מדגם על פני השטח PEI.
לפני שהנקודה יכולה להתייבש, מעבירים את הצלחת למיכל המכיל שכבה של 1.5 מונופוטזיום פוספט טוחן שהוא רדוד מספיק כדי לא לגעת במקום דגימת המקור. מכסים את המיכל עם אטום אטום, ומאפשרים עלייה נוזלית לראש הסדין הקצוץ באורך 15 ס"מ. לאחר מכן, הסר את הכרומטוגרמה המפותחת במלואה וייבש אותה בטמפרטורת החדר.
חותכים ומשליכים את החלק העליון של הכרומטוגרמה המכילה את P32 בחינם לפסולת רדיואקטיבית. השתמש במסך זרחן כדי לחשוף את הסרטים האודיורדיוגרפיים בן לילה. למחרת, לפתח את הסרט ולהשתמש זרחן כדי ללכוד ולכימת את האות הירוק של הזרחן.
לאחר מכן, השתמש בתוכנת ImageJ כדי לכמת את הנקודות הרדיואקטיביות. לאחר לעורר מתח או רעב לזמן מספיק כדי לאפשר הצטברות ppGpp, להשתמש בשיטה המתאימה כדי להפוך את הלחץ. קח דגימות כל 20 עד 30 שניות עד שתי דקות ועבד את הדגימות כפי שתואר קודם לכן.
לאחר פיתוח TLC, ואת רמות ppGpp מתקבלים במהלך קורס הזמן, לתכנן את התוכן ppGpp שיורית על עלילה חצי לוגריתמית לעומת הזמן. במחקר זה, תאים הגדלים ב- MOPS המכילים את כל חומצות האמינו למעט ILV מסומנים עם P32. לאחר שכותרתו, L ואלין מתווסף לייצר רעב isoleucine.
לאחר חמש דקות, עלייה ישנה של שתיים וחצי ברמות הטטרה והפנטפוספט של גואנוזין התרחשה. פקד שלילי של מדגם ללא תווית תא משמש כדי לזהות תרכובות אפשריות כי הם לא אורתופוספט במקור P32. היפוך של רעב איזולאוצין יכול להיות מושגת על ידי כלוראמפניקול, מעכב של סינתזת חלבון, אשר מפחית את הצריכה של tRNA איזולאוצין טעון, בתורו, משחזר יחס גבוה של טעון tRNA טעון.
הפעלה של סינתזת ppGpp חזקה בתתיווך rela בוטלה, המאפשר מידה של השפלה ppGpp ללא הפרעה על ידי סינתזה שיורית. במקרה זה, ppGpp נרקב עם זמן מחצית חיים של כ 64 שניות. חשוב לתת לתאים לגדול במשך כמה דורות כדי להשיג תיוג אחיד לפני גרימת כל מתח או רעב.
מכיוון ש- ppGpp מתפשט באופן נרחב בקרב חיידקים, ניתן ליישם שיטה זו על אורגניזמים אחרים. שינוי שיטת הפיתוח של TLC יכול לאפשר הפרדה נאותה של כל הנוקלאוטידים הרגולטוריים, כגון ppApp. P52 הוא איזוטופ פולט טוב יותר, ולכן חשוב להשתמש מיגון תקין כראוי להשליך כראוי כל שאריות.
