Questo metodo misura i livelli del regolatore globale ppGpp in diverse condizioni di crescita e situazioni di stress. PpGpp può essere trovato in batteri gram positivi e negativi, così come nel cloroplasto. PpGpp ha un rapido esordio in secondi, che porta a una seconda relazione veloce una volta prodotta la sollecitazione.
Allo stesso tempo, ha un'emi vita breve, fino a 30 secondi. Pertanto, è necessario monitorare molte impostazioni cultura a intervalli di tempo che possono variare da 10 secondi a ore, incluse le transizioni stressate. Inoltre, le colture batteriche radiolabel nelle stoviglie a microtitore facilitano campionamenti ad alta produttività che consentono molteplici repliche tecniche e biologiche.
Assicurarsi di seguire le misure di sicurezza appropriate quando si lavora con materiali radioattivi. Per iniziare questa procedura, preparare tutti i supporti come indicato nel protocollo di testo. Coltivare colture notturne in mezzi MOPS con tre fosfati di sodio millimolari.
Aggiungere 550 microlitri di mezzi MOPS, che contno 0,2 portatori di fosfato di sodio micromolare e 30 microlitri di ogni inoculo batterico ai pozzi di una piastra di 24 pozza. Ciò si tradurrà in un inoculo iniziale con un OD600 di 0,1. Aggiungere nuovi supporti a uno e un controllo di sterilità.
Posizionare la piastra in un'incubatrice tremante a 37 gradi celsius, tremando a 900 giri/min per 30 minuti. La crescita può essere monitorata utilizzando un lettore di lastre con una piastra replicata in parallelo in supporti privi di p32 utilizzando un lettore di lastre durante l'incubazione nelle stesse condizioni. Aggiungere quindi 100 microcuries di p32 ortofosfato ad ogni pozzo della piastra.
Far crescere le colture in un incubatore di scuotimenti per uno o due raddoppi per consentire all'etichetta esterna di equilibrare in gran parte con piscine nucleotidiche intercellulari. Per una corretta visualizzazione, nessuno dei materiali attivi è stato utilizzato in questo video. In un vero esperimento, è necessaria una corretta schermatura e un monitoraggio costante per la contaminazione con un misuratore di rilevamento.
In primo luogo, indurre lo stress utilizzando un metodo appropriato per il tipo di stress studiato. Aggiungere quindi 20 microlitri di ciascun campione di cellule etichettate a un tubo PCR separato da 0,2 millilitri, contenente 20 microlitri di acido formico molare freddo ghiaccio. Posizionare immediatamente i campioni sul ghiaccio secco.
Migliora l'efficienza di estrazione cellulare di tre cicli di congelamento e scongelamento. Poco prima di avvistare i cromatogrammi a strato sottile di cellulosa PEI, centrifugare i campioni per un minuto alla massima velocità per pellet cell debris. In primo luogo, impostare una piastra TLC di cellulosa PEI da 20 per 20 centimetri.
Usa le forbici per rimuovere i primi cinque centimetri. E usa una matita morbida per contrassegnare una linea di origine a un centimetro dal bordo. Applicare una goccia a cinque microliter di ciascun campione sulla superficie PEI.
Prima che il punto possa asciugarsi, trasferire la piastra in un serbatoio contenente uno strato di 1,5 fosfato monopotassio molare abbastanza superficiale da non toccare il punto del campione di origine. Coprire il serbatoio con una tenuta ermetica e consentire la salita liquida verso la parte superiore del foglio tagliato di 15 centimetri. Successivamente, rimuovere il cromatogramma completamente sviluppato e asciugarlo all'aria a temperatura ambiente.
Tagliare e scartare la parte superiore del cromatogramma contenente il P32 libero in scorie radioattive. Utilizzare uno schermo al fosforo per esporre i film audioradiografici durante la notte. Il giorno dopo, sviluppa il film e usa un fosforimager per catturare e quantificare il segnale verde del fosforo.
Quindi, utilizzare il software ImageJ per quantificare le macchie radioattive. Dopo aver provocato stress o fame per un tempo sufficiente a consentire l'accumulo di ppGpp, utilizzare un metodo appropriato per invertire lo stress. Prelevare campioni ogni 20-30 secondi per un massimo di due minuti ed elaborare i campioni come descritto in precedenza.
Una volta sviluppato il TLC e ottenuti i livelli di ppGpp durante il corso del tempo, tracciare il contenuto ppGpp residuo su un grafico semilogaritmico rispetto al tempo. In questo studio, le cellule coltivate in MOPS contenenti tutti gli amminoacidi ad eccezione dell'ILV sono etichettate con P32. Una volta etichettato, L valine viene aggiunto per produrre fame di isoleucina.
Dopo cinque minuti, si è verificato un aumento di due anni e due anni e mezzo dei livelli di tetra e pentafosfato di guanosina. Un controllo negativo di un campione etichettato privo di cellule viene utilizzato per rilevare possibili composti che non sono ortofosfati nella sorgente P32. L'inversione della fame di isoleucina può essere ottenuta dal cloramfenicolo, un inibitore della sintesi proteica, che riduce il consumo di tRNA di isoleucina caricato e, a sua volta, ripristina alti rapporti di tRNA carico a non carico.
L'attivazione della forte ppGpp sintetasi rela-mediata è abolita, il che consente una misura della degradazione ppGpp non perturbata dalla sintesi residua. In questo caso, ppGpp decade con un'emidità di circa 64 secondi. È importante lasciare che le cellule crescano per un paio di generazioni per ottenere un'etichettatura uniforme prima di indurre qualsiasi stress o fame.
Poiché il ppGpp è ampiamente diffuso tra i batteri, questo metodo può essere applicato ad altri organismi. La modifica del metodo di sviluppo delle TLC potrebbe consentire la corretta separazione di tutti i nucleotidi regolatori, come ppApp. P52 è un isotopo dell'emettitore migliore, quindi è importante utilizzare una corretta schermatura e scartare correttamente eventuali residui.
