使用微蒂特萝卜无线电标签进行多维欧大肠杆菌测量 (p) ppGpp,然后是薄层色谱

该方法测量不同增长条件和压力情况下全球调节器 ppGpp 的水平。PpGpp 可以在克阳性和阴性细菌以及叶绿体中找到。PpGpp 在几秒钟内快速启动，一旦产生应力，即导致快速的第二次关系。

同时，它有一个短的半寿命，长达30秒。因此，需要以时间间隔监控许多区域性，这些区域性的时间间隔可能从 10 秒到小时不同，包括压力过渡。我们还在微刺激器培养皿中对细菌培养进行放射性标记，从而促进高通量采样，从而允许进行多种技术和生物复制。

处理放射性物质时，请务必遵循适当的安全措施。若要开始此过程，请准备文本协议中概述的所有媒体。在 MOPS 介质中生长带三毫摩尔磷酸钠的隔夜培养。

加入550微升的MOS介质，在24孔板的井中连续增0.2微摩尔磷酸钠载体和30微升每个细菌 inculum。这将导致 OD600 为 0.1 的初始孵化。将新介质添加到无菌控制中。

将板在 37 摄氏度的摇晃培养箱中，在 900 RPM 下摇晃 30 分钟。在缺少 p32 的介质中，使用板读卡器在相同条件下孵育时，可以使用具有复制板的板读取器进行实时监控生长。接下来，在板的每个井中加入100个p32磷酸盐的微曲线。

在摇动的培养箱中生长培养培养物，使培养成一到两倍，使外部标签与细胞间核苷酸池基本平衡。为了正确可视化，此视频中未使用任何活动材质。在实际实验中，需要适当的屏蔽，以及使用测量仪持续监测污染情况。

首先，使用适合所研究的压力排序的方法诱导应力。接下来，将每个标记细胞样品的20微升添加到单独的0.2毫升PCR管中，该管含有20微升的冰冷六摩尔甲酸。立即将样品放在干冰上。

通过三个循环的冷冻和解冻提高细胞提取效率。在发现PEI纤维素薄层色谱图之前，以最大速度将样品离心一分钟，以颗粒细胞碎片。首先，设置一个20至20厘米的PEI纤维素TLC板。

用剪刀去除前五厘米。并使用一支软铅笔将原点线从边缘标记一厘米。将每个样品的五微升液滴涂抹到PEI表面。

在该点干燥之前，将板转移到含有1.5摩尔单钾磷酸盐层的罐中，该层较浅，不能接触原点样品点。用气密密封盖住油箱，让液体升到 15 厘米修剪的薄片的顶部。之后，取出完全开发的色谱，在室温下空气干燥。

将含有自由 P32 的色谱图的顶部切割并丢弃为放射性废物。使用荧光屏在一夜之间曝光音频放射片。第二天，开发薄膜，并使用荧光粉来捕获和量化荧光粉的绿色信号。

然后，使用 ImageJ 软件对放射性点进行定量化。在引发压力或饥饿的时间足以允许 ppGpp 积累后，使用适当的方法来扭转压力。每 20 到 30 秒采集一次样品，最多两分钟，然后像前面描述的那样处理样品。

一旦开发TLC，并在时间过程中获得ppGpp的级别，在半历史图与时间上绘制剩余ppGpp内容。在这项研究中，在含有除 ILV 以外的所有氨基酸的 MOPS 中生长的细胞都标有 P32。一旦标记，L瓦林被添加产生二氧核素饥饿。

五分钟后，瓜诺辛的四磷和五磷酸盐含量增加了两岁半。对无细胞标记样品进行负对，用于检测P32源中未为正交磷酸盐的可能化合物。抑制蛋白质合成的氯霉素可逆转二氯蔗素饥饿，从而减少带电的二氯蔗氨酸 tRNA 的消耗，进而恢复高充电与未充电 tRNA 的比率。

强重按中移pp合成酶的激活被废除，这允许一种尺度的ppGpp降解不受残余合成的干扰。在这种情况下，ppGpp 衰减的半衰期约为 64 秒。重要的是让细胞生长几代人，以达到一个统一的标签之前，诱导任何压力或饥饿。

由于ppGpp在细菌中广泛传播，因此可以应用于其他生物体。修改TLC开发方法可以正确分离所有调节性核苷酸，如ppApp。P52 是更好的发射同位素，因此使用适当的屏蔽和正确丢弃任何残留物非常重要。