Этот метод измеряет уровни глобального регулятора ppGpp в различных условиях роста и стрессовых ситуациях. PpGpp можно найти в грамположительных и отрицательных бактерий, а также в хлоропласт. PpGpp имеет быстрое начало в секундах, которые ведут к быстрому второму отношению как только усилие произведено.
В то же время, он имеет короткий период полу-жизни, до 30 секунд. Таким образом, необходимо контролировать многие культуры с интервалами времени, которые могут варьироваться от 10 секунд до нескольких часов, включая напряженные переходы. Мы также радиолабеле бактериальных культур в блюдах микротитр облегчает высокую пропускную способность выборки, которые позволяют несколько технических и биологических репликаций.
Убедитесь в том, чтобы следовать надлежащим мерам безопасности при работе с радиоактивными материалами. Для начала этой процедуры подготовьте все средства массовой информации, изложенные в текстовом протоколе. Выращиваем ночные культуры в MOPS-средствах массовой информации с тремя миллимолярдным фосфатом натрия.
Добавьте 550 микролитров носителей MOPS, продержав 0,2 микромолярный фосфатный носитель натрия и 30 микролитров каждого бактериального инокулума к скважинам 24 скважины. Это приведет к первоначальному inoculum с OD600 из 0,1. Добавьте свежие средства массовой информации к одному, а также контроль стерильности.
Поместите тарелку в трясущимся инкубатором при 37 градусах по Цельсию, встряхивая при 900 об/мин в течение 30 минут. Рост можно контролировать с помощью считыватель пластин с пластиной репликации параллельно в средствах массовой информации не хватает p32 с помощью считыватель пластин при инкубации в тех же условиях. Затем добавьте 100 микрокурей р32 орфосфата к каждому колодец пластины.
Выращивайте культуры в трясущимся инкубаторе для одного-двух удвоений, чтобы позволить внешней этикетке в значительной степени уравножаться с межклеточными нуклеотидными бассейнами. Для правильной визуализации, ни один из активного материала не был использован в этом видео. В реальном эксперименте требуется надлежащее экранирование, а также постоянный мониторинг загрязнения с помощью измеритель.
Во-первых, вызвать стресс с помощью метода, подходящего для рода стресс изучены. Затем добавьте 20 микролитров каждого помеченного образца клеток в отдельную 0,2 миллилитровую ПЦР-трубку, содержащую 20 микролитров ледяной шестиярой милолярной мимической кислоты. Сразу же поместите образцы на сухой лед.
Повысить эффективность клеточной экстракции на три цикла замораживания и оттаивания. Незадолго до обнаружения PEI целлюлозы тонкого слоя хроматограммы, центрифуга образцов в течение одной минуты на максимальной скорости гранулы ячейки мусора. Во-первых, изложить 20 на 20 сантиметров PEI целлюлозы TLC пластины.
Используйте ножницы, чтобы удалить верхние пять сантиметров. И используйте мягкий карандаш, чтобы отметить линию происхождения в одном сантиметре от края. Нанесите на поверхность PEI пять капель микролитров каждого образца.
Прежде чем пятно может высохнуть, перенесите пластину в бак, содержащий слой 1,5 молярного монопотассиума фосфата, который является достаточно мелким, чтобы не касаться места происхождения образца. Обложка бак с герметичным уплотнением, и позволяют жидкости восхождение на вершину 15 сантиметров обрезается листа. После этого удалите полностью разработанную хроматограмму и высушите ее при комнатной температуре.
Вырезать и отбросить верхнюю часть хроматограммы, содержащей свободный P32 в радиоактивные отходы. Используйте фосфорный экран, чтобы разоблачить аудиорадиографические пленки в одночасье. На следующий день разработать пленку и использовать фосфоримагер для захвата и количественного фосфора зеленый сигнал.
Затем используйте программное обеспечение ImageJ для количественной оценки радиоактивных пятен. После провоцирования стресса или голодания на время достаточно, чтобы ppGpp накопления, использовать соответствующий метод, чтобы обратить вспять стресс. Возьмите пробы каждые 20-30 секунд на срок до двух минут и обработать образцы, как описано ранее.
После того, как TLC разработан, и уровни ppGpp получены в течение времени курса, участок остаточного содержания ppGpp на полулогаритмическом участке по сравнению со временем. В этом исследовании клетки, выращенные в MOPS, содержащие все аминокислоты, за исключением ILV, помечены P32. После маркировки, L валин добавляется для производства изолеуцина голода.
Через пять минут произошло двух- и двух с половиной лет повышение уровня тетра и пентафосфата гуанозина. Отрицательный контроль образца без маркировки клеток используется для обнаружения возможных соединений, которые не являются ортофосфатом в источнике P32. Разворот изолеуцинового голодания может быть достигнут с помощью хлорамфеникол, ингибитора синтеза белка, который снижает потребление заряженной изолеуциновой тРНК и, в свою очередь, восстанавливает высокие соотношения заряженных к незаряженной тРНК.
Активация сильного реля-опосредованного ppGpp синтезетазы отменяется, что позволяет измерять деградацию ppGpp невозмутимой остаточным синтезом. В этом случае, ppGpp распадается с полусемейки около 64 секунд. Важно, чтобы клетки растут в течение нескольких поколений для достижения равномерной маркировки, прежде чем вызывать стресс или голод.
Поскольку ppGpp широко распространен среди бактерий, этот метод может быть применен к другим организмам. Модификация метода разработки TLC может позволить правильное разделение всех регуляторных нуклеотидов, таких как ppApp. P52 является лучшим изотопом излучателей, поэтому важно использовать надлежащий экранирование и правильно отбросить любые остатки.
