פרוטוקול זה מתאר שיטה לתכנת מחדש תאים דם ומונונוקלר לתאי גזע עצביים שניתן להשתמש בהם לטיפול במחלות ניווניות, כגון מחלת פרקינסון. הוא מציע מקור תאים אוטולוגי לטיפול במחלות ניווניות. כמו כן, מסגרת הזמן הנדרשת להמרה לתאי גזע עצביים המושרים וההתמדה לסוגי התאים הרצויים קצרה יותר מאשר לתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים.
תאי גזע עצביים המושרה בעלי יכולת התפשטות טובה ו ניתן לשנות את קנה המידה שלהם לפני היישום. מאז iNSCs ניתן לציין לתוך תאים עצביים שונים ספציפיים לאזור, כגון נוירונים בחוט השדרה או נוירונים מוטוריים, שיטה זו עשויה להיות מורחבת לטיפול במחלות נוירולוגיות אחרות. ההליך כולו לוקח זמן רב, עם כל השלבים הקשורים וקריטי, כך הדגמה חזותית נותן מושג על איך התאים נראים ומספק כמה טיפים כדי להבטיח דור מוצלח של התאים הרצויים.
כדי להתחיל, להעביר דם הווריה היקפי מבודד בעבר לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר, ולדלל אותו עם נפח שווה של PBS של דולבקו סטרילי. בצינור חרוט נוסף של 50 מיליליטר, הכינו 15 מיליליטר של מדיום שיפוע צפיפות מעוקר. להטות את הצינור בזווית של 45 מעלות, לאט ובזהירות להניח 30 מיליליטר של דם היקפי מדולל על המדיום שיפוע צפיפות.
צנטריפוגה הצינור ב 800 פעמים g במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר עם בלם צנטריפוגה להגדיר בתדר כבוי. שאף את שכבת הפלזמה הצהובה העליונה והשליך אותה. השתמש פיפיטה 10 מיליליטר להעביר את לבן, שכבת סרט דק מעונן המכיל תאים mononuclear לצינור חרוט חדש 50 מיליליטר.
הוסף 30 מיליליטר של D-PBS לצינור עם MNCs, וצנטריפוגה ב 600 פעמים g במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר השלכת supernatant, להוסיף 45 מיליליטר של D-PBS ו לעשות שימוש חוזר בתאים. לאחר צנטריפוגה הצינור ב 400 פעמים g במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, להשליך את העל טבעי.
השתמש מחדש בתאים עם חמישה מיליליטר של D-PBS, ספור את התאים החיים בשיטת ההדרה הכחולה trypan, להפריש את MNCs הדרושים להרחבה, ולהקפיא את התאים הנותרים לשימוש עתידי. ביום מינוס 14, זרע MNCs בצפיפות של שניים עד שלושה מיליון תאים למיליליטר ל הבאר של צלחת שש באר עם 1.5 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס, בינוני MNC מחומם מראש. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני במשך יומיים.
ביום מינוס 11, להשתמש פיפטה מעוקרת כדי לאסוף את התאים עם המדיום ולהעביר צינור חרוט חדש 15 מיליליטר. צנטריפוגה ב 250 פעמים g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, להשליך את supernatant, ו resuspend התאים במיליליטר אחד של מדיום MNC מחומם מראש. לאחר ספירת התאים קיימא עם כחול trypan, זרע MNCs בצפיפות של מיליון תאים למיליליטר במדיום MNC מחומם מראש בצלחת שש באר.
דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני במשך שלושה ימים, ואיסוף תאים חוזרים, צנטריפוגה, וציפוי בינוני MNC בימים מינוס שמונה ומינוס ארבעה. וירוס סנדאי בהליך זה הוא מסוכן, וכל ההליכים מעורבים וירוס סנדאי חייב להתבצע בקבינט בטיחות. וכל הטיפים והצינורות שנחשפו לנגיף סנדאי צריכים להיות מטופלים באתנול או באקונומיקה לפני ההשלכה.
ביום אפס, לאסוף את התאים במדיום MNC ולהעביר צינור חרוט 15 מיליליטר. לאחר צנטריפוגה התאים ב 200 פעמים g במשך חמש דקות, שאפו את supernatant ו resuspend התאים עם מיליליטר אחד של מדיום MNC מחומם מראש. לספור את התאים קיימא עם כחול trypan, ולאחר מכן resuspend אותם עם מדיום MNC מחומם מראש לריכוז של 200, 000 תאים לגם בצלחות 24 באר.
להפשיר את הצינורות הוסרו מאחסון מינוס 80 מעלות צלזיוס המכיל וירוס סנדאי באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך חמש עד 10 שניות, ולאחר מכן להשאיר אותם להפשיר בטמפרטורת החדר. לאחר הפשרתם, מניחים אותם מיד על קרח. הוסף את וירוס סנדאי המופשר ל הבארות של צלחת 24 באר עם MNCs בריבוי של זיהום של 10.
כדי להקל על ההחזקה של תאים, צנטריפוגה הצלחות ב 1, 000 פעמים גרם במשך 30 דקות ואחרי זה למקם את הצלחות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני. ביום הראשון, להעביר את התאים עם המדיום לצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר. כדי לנתק עוד יותר את התאים הנותרים, לשטוף את בארות עם מיליליטר אחד של מדיום MNC לגם ולהוסיף את התאים עם בינוני לצינור.
לאחר צנטריפוגה השעיית התא ב 200 פעמים g במשך חמש דקות, לשאוף את supernatant, resuspend התאים עם 500 microliters של מדיום MNC מחומם מראש טרי, ולהוסיף באר של צלחת 24 באר. ביום השני, השתמש במיליליטר אחד לגם של 50 מיקרוגרם מדוללים בעבר לכל מיקרוליטר פולי-D-ליסין ב- D-PBS כדי לצפות שש צלחות בארות לפחות שעתיים בטמפרטורת החדר. שאף פולי-D-לינזין מצלחות שש בארות, ויבש על הספסל הנקי האנכי במשך כ -10 דקות.
לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד ל באר של חמישה מיקרוגרם מדולל בעבר לכל למינין מיליליטר לצלחות שש בארות, ודגירה במשך ארבע עד שש שעות ב 37 מעלות צלזיוס לציפוי. לשטוף את הצלחות עם D-PBS לפני השימוש. ביום השלישי, צלחת כל MNCs סנדאי התמורמים וירוס במדיום תאי גזע עצביים המושרה על צלחות פולי-D-ליסין / למינין מצופה שש בארות.
בימים 5 ו-7, מוסיפים בעדינות מיליליטר אחד של 37 מעלות צלזיוס, מדיום iNSC מחומם מראש לכל באר של צלחות שש בארות. מהיום התשיעי עד היום ה-28, החליפו את המדיום במדיום iNSC טרי וחם מדי יום. לפקח על הופעת מושבות iNSC, ובמשך כשבועיים עד שלושה שבועות לבחור מושבות עם מורפולוגיה מתאימה באמצעות פיפטים זכוכית שרוף ולהעביר כל מושבה ל באר נפרדת של צלחת שש בארות להתרחבות.
כדי להקים מודלים חד-צדדיים של עכברים עם 6 ירוקסידופאמין, גילחו את ראשו של עכבר הרדמה, מבוגר, זכר, SCID-בז', והחל משחת עיניים אריתרומיצין. מניחים את העכבר על המנגנון הסטריאוטקסי, ולתקן את העכבר עם פסים חותכים. הכנס את כוסות האוזן כראוי כדי למקם את ראש העכבר בצורה מאובטחת ומתאימה.
לעקר את הראש עם povidone יוד ואלכוהול isopropyl, ולאחר מכן להשתמש בלהב אזמל לעשות חתך קשת כ 1.5 ס"מ על עור הראש, חושף את הגולגולת. כווננו את הסורג החותך ואת האוזן כדי להפחית את הפרש הגובה בין ברגמה ללמדה לפחות מ-0.1 מילימטרים. לאט לנוע ולהוריד את קצה מחט microsyringe לכיוון bregma, ולהתייחס ברגמה כנקודת האפס.
הזז את הקצה למיקום עם קואורדינטות של 0.5 מילימטרים לפנים ו- 2.1 מילימטרים או יותר ביחס לבריגמה. לסגת מהטיפ, לסמן את הנקודה עם עט סמן, ו, עם מקדחה אלקטרונית, burr חור קטן לתוך הגולגולת. לחלץ שני microliters של חמישה מיקרוגרם לכל מיליליטר 6-יתד פתרון לתוך microsyringe.
מחזירים את המחט לנקודה המסומנת, ומכניסים את המחט ל-3.2 מילימטרים. להזריק את פתרון 6-hyroxydopamine מהמזרק בקצב של מיקרוליטר אחד לדקה, להשאיר את מחט ההזרקה במקום עוד חמש דקות, ולאחר מכן לחזור בו לאט. לאחר סגירת החתך עם תפרים, להחיל משחת עיניים אריתרומיצין על העיניים שוב.
מוציאים את העכבר מהמנגנונים הסטריאוטוקסיים, מכניסים אותו לכלוב ההחלמה ומאפשרים גישה למזון ומים עד שהוא חוזר להכרה. לאחר PBMNCs נדבקו SEV, המורפולוגיה שלהם השתנתה ותאים עברו מוות דרסטי עד היום החמישי. מושבות INSC הופיעו ביום ה-12.
לאחר קטיף והעברת שיבוטים iNSC להתרחבות עבור מספר קטעים, הם הראו מורפולוגיה טובה יכול לחדש את עצמו באופן הדוק במדיום iNSC, או בצורת monolayer או כמו כדורים. לאחר 24 ימים של בידול, iNSCs זוהו נוירונים דופאמין כמו רובם הביעו טירוסין hydroxylase, תיבת forkhead A2, ו נוירון ספציפי סוג III בטא-tubulin סמנים. לאחר הקמת חד צדדי 6-hyroxydopamine-נפגע פרקינסון מודלים עכבר, הערכה התנהגותית נערכה כדי להעריך את הסימפטומים של מחלת פרקינסון.
העכברים שקיבלו השתלת תאים הראו שיפור משמעותי בתפקוד המוטורי. היקף הנגע 6-hyroxydopamine-induced אומת על ידי כתמים immunofluorescent פוסט-מורטם עבור TH בסטריאטום, חבילת forebrain המדיה, ו substantia ניגרה pars compacta. האותות החיוביים TH נמצאו מאוד בסטריאטום שבו תאים הושתלו וגם התאוששו קלות ב SN. שלושה חודשים לאחר ההשתלה, בקרב תאים ששרדו, כ -13.84% היו נוירונים דופאמין חיוביים TH.
כ-91.72% מהתאים החיוביים ל-TH הביעו קולטן גרעיני יתום, כ-86.76% באו לידי ביטוי FOXA2 וכ-98.77% מתויגים במשותף באשלגן מתקן ג'י-חלבון. בעת הנחת 30 מיל של דם היקפי מדולל על המדיום שיפוע צפיפות, אנא עשה זאת לאט ובזהירות, לא להפריע ממשק הדרגתי. יש לדאוג כדי למנוע הפשרה והקפאה חוזרות ונשנות של וירוס סנדאי כדי להבטיח פעילות וירוס גבוהה.
בעת תכנות מחדש של תאי מונונוקלאר דם היקפיים לתאי גזע עצביים המושרים, אנא התבונן מקרוב במורפולוגיה של תאים מדי יום. כמו כן, 6-הידרוקסידופמין הוא רגיש לאור וטמפרטורה. הקפד להגן על הפתרון מפני אור, ולשמור אותו על קרח לפני השימוש.
בעקבות הליך זה, ניתן להמשיך לחקור את מנגנוני המחלה באמצעות נוירונים דופאמינרגיים משפחתיים שמקורם בחולה בתרבות. אפשר גם להמשיך לחקור כיצד התאים המושתלים משפיעים על המעגלים העצביים הפגומים.
