이 프로토콜은 파킨슨 병과 같은 신경 퇴행성 질환을 치료하는 데 사용할 수있는 신경 줄기 세포로 혈액 및 단일 핵 세포를 재프로그래밍하는 방법을 설명합니다. 그것은 신경 퇴행성 질병을 취급하기 위하여 자기 세포 근원을 제공합니다. 또한, 유도된 신경줄기 세포로 의 전환에 필요한 시간 프레임과 원하는 세포 유형으로분화하는 것은 유도된 다능성 줄기 세포보다 짧다.
유도된 신경 줄기 세포는 좋은 증식 능력을 가지고 있으며 적용 전에 확장 될 수 있습니다. iNSC는 척수 뉴런 이나 운동 뉴런과 같은 다른 지역 별 신경 세포로 지정될 수 있기 때문에, 이 방법은 그밖 신경학상 질병의 처리를 위해 확장될 수 있습니다. 전체 절차는 모든 단계와 관련된 중요한 시간이 오래 걸리므로 시각적 데모는 세포가 어떻게 생겼는지에 대한 아이디어를 제공하고 원하는 세포의 성공적인 생성을 보장하기위한 몇 가지 팁을 제공합니다.
시작하려면 이전에 분리된 말초 정맥 혈액을 50밀리리터 원내 튜브로 옮기고, 동일한 양의 멸균 덜벡코의 PBS로 희석합니다. 또 다른 50 밀리리터 원내 튜브에서는 멸균 밀도 그라데이션 배지 15밀리리터를 준비합니다. 튜브를 45도 각도로 기울이고 희석된 말초 혈액 30밀리리터를 밀도 그라데이션 배지에 천천히 조심스럽게 놓습니다.
원심분리기는 실온에서 15분 동안 800배 g의 원심분리기를 하고 원심분리기 브레이크가 꺼져 있습니다. 노란색, 상부 플라즈마 층을 흡인하고 폐기하십시오. 10밀리리터 파이펫을 사용하여 단핵 세포를 포함하는 흰색의 흐린 얇은 필름 층을 새로운 50밀리리터 원내 튜브로 옮느라 한다.
MMC와 튜브에 D-PBS30 밀리리터를 추가하고, 원심분리기는 섭씨 4도에서 10분 동안 600배 g로 추가합니다. 상체를 폐기한 후 D-PBS 의 45 밀리리터를 추가하고 세포를 다시 중단합니다. 4섭씨에서 10분 동안 400배g의 원심분리후, 상퍼를 폐기하십시오.
D-PBS의 5 밀리리터로 세포를 다시 중단하고, trypan 블루 제외 방법으로 라이브 셀을 계산하고, 확장에 필요한 MC를 따로 설정하고, 향후 사용을 위해 나머지 셀을 동결합니다. 14일 영하 14일, 종자 MC들은 6웰 플레이트당 밀리리터당 2~300만 개의 세포밀도로 37도, 미리 따뜻워진 MNC 배지의 1.5밀리리터를 갖는다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 이틀 간 배양합니다.
11일 영하 11일에는 살균된 파이펫을 사용하여 배지로 세포를 수집하고 새로운 15밀리리터 원추형 튜브로 이송한다. 원심분리기는 실온에서 5분 동안 250배 g로, 상체를 폐기하고, 전침이 도는 MNC 배지의 1밀리리터로 세포를 재연한다. 트라이팬 블루로 실행 가능한 세포를 계산한 후, 6웰 플레이트에서 미리 데운 MNC 배지에서 밀리리터당 100만 개의 세포밀도로 MC를 시드한다.
섭씨 37도, 이산화탄소 5% 3일 동안 배양하고, MNC 배지에서 세포 수집, 원심분리 및 도금을 영하 8도및 4일 동안 반복한다. 센다이 바이러스는 이 절차에서 위험하며 센다이 바이러스와 관련된 모든 절차는 안전 캐비닛에서 수행해야 합니다. 그리고 센다이 바이러스에 노출된 모든 팁과 튜브는 폐기 전에 에탄올 또는 표백제로 처리되어야 합니다.
0일째에 MNC 배지에서 세포를 수집하고 15밀리리터 원추형 튜브로 이송합니다. 5 분 동안 200 배 g에서 세포를 원심 분리 한 후, 슈퍼 나탄을 흡인하고 미리 따뜻하게 된 MNC 배지의 1 밀리리터로 세포를 다시 중단합니다. trypan blue로 실행 가능한 세포를 계산한 다음 24웰 플레이트에서 웰당 200, 000 세포의 농도로 미리 데운 MNC 배지로 다시 보냅니다.
37도 섭씨 수조에서 센다이 바이러스를 함유한 영하 80도 저장에서 제거된 튜브를 5~10초 동안 해동한 다음 실온에서 해동하도록 둡니다. 해동하면 즉시 얼음 위에 놓습니다. 해동된 센다이 바이러스를 MMC와 함께 24웰 플레이트의 우물에 첨가하여 10의 감염의 다발성에서 추가합니다.
세포의 부착을 용이하게 하기 위해 플레이트를 1, 000배 g에서 30분 동안 원심분리하고 그 후에는 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 인큐베이터에 배치합니다. 첫날에는 배지로 세포를 15밀리리터 원심분리기 튜브로 이송합니다. 남은 세포를 더 분리하려면 우물당 MNC 배지 1밀리리터로 헹구고 배지가 있는 세포를 튜브에 추가합니다.
셀 서스펜션을 5분 동안 200배 g로 원심분리한 후, 수퍼네티드를 흡인하고, 500마이크로리터의 신선한 사전 데운 MNC 배지로 세포를 재연하고, 24웰 플레이트의 웰에 첨가한다. 둘째 날, D-PBS의 마이크로리터 폴리-D-리신당 이전에 희석된 50마이크로그램당 1밀리리터를 사용하여 실온에서 최소 2시간 동안 6웰 플레이트를 코팅합니다. 6웰 플레이트에서 폴리-D-리신을 흡인하고 수직 깨끗한 벤치에서 약 10분 동안 건조시합니다.
그런 다음 이전에 희석 된 밀리리터 라미닌 당 1 밀리리터를 6 웰 플레이트에 넣고 37도에서 4 ~ 6 시간 동안 배양하십시오. 사용하기 전에 D-PBS로 접시를 씻으시면 됩니다. 셋째 날, 폴리-D-리신/라미닌 코팅 6웰 플레이트상에 유도된 신경줄기 세포 배지에서 모든 센다이 바이러스 변환 된 MC를 플레이트.
5일과 7일에는 37도의 밀리리터 1밀리리터를 6웰 플레이트의 각 웰에 미리 데워진 iNSC 배지를 부드럽게 추가합니다. 9일부터 28일까지, 매체를 매일 신선한 미리 데워진 iNSC 매체로 교체하십시오. iNSC 식민지의 출현을 모니터링하고, 약 2~3주 동안 불에 탄 유리 파이펫을 사용하여 적절한 형태로 식민지를 선택하고 확장을 위해 6웰 플레이트의 별도의 우물로 각 식민지를 옮기다.
일방적인 6-hyroxydopamine 병변 마우스 모형을 설치하기 위하여는, 마취, 성인, 남성, SCID 베이지 마우스의 머리를 면도하고, 에리스로마이신 눈 연고를 적용합니다. 입체 장치에 마우스를 놓고 절개 막대로 마우스를 고정합니다. 이어 컵을 올바르게 삽입하여 마우스 헤드를 고정하고 적절하게 배치합니다.
포비도요오드와 이소프로필 알코올로 머리를 살균한 다음 메스 블레이드를 사용하여 머리 피부에 약 1.5센티미터 의 처진 절개를 하여 두개골을 노출시합니다. 절개 막대와 이어 바를 조정하여 브레그마와 람다의 높이 차이를 0.1밀리미터 미만으로 줄입니다. 천천히 이동하고 bregma를 향해 현미경 주사 바늘의 끝을 낮추고, 제로 포인트로 bregma를 치료.
팁을 앞면 0.5밀리미터및 브레그마대비 측면 2.1밀리미터의 좌표로 위치로 이동합니다. 팁을 철회하고 마커 펜으로 점을 표시하고 전자 드릴로 두개골에 약간의 구멍을 버링합니다. 밀리리터 당 5 마이크로 그램의 두 마이크로 리터를 추출 6-hyroxydopamine 용액 마이크로 시링에.
바늘을 표시된 지점으로 되돌리고 바늘을 등쪽/복부 3.2밀리미터에 삽입합니다. 분당 1 마이크로 리터의 속도로 주사기에서 6-hyroxydopamine 용액을 주입, 또 다른 5 분 동안 장소에 주입 바늘을 두고, 다음 천천히 철회. 봉합사로 절개를 닫은 후, 다시 눈에 에리스로 마이신 눈 연고를 적용합니다.
스테레오탁스 장치에서 마우스를 제거하고 복구 케이지에 넣고 의식을 되찾을 때까지 음식과 물에 접근할 수 있도록 하십시오. PBMC가 SeV에 감염된 후, 그들의 형태는 변화하고 세포는 5 일째까지 급격한 죽음을 겪었습니다. INSC 식민지는 12일째에 나타났다.
여러 구절에 대한 확장을 위해 iNSC 클론을 골라낸 후, 그들은 좋은 형태를 보였고 iNSC 배지에서 단층 형태나 구체로서 안정적으로 자체 갱신할 수 있었습니다. 24일 간의 분화 후, iNSC는 티로신 하이드록실라제, 포크헤드 박스 A2 및 뉴런 특이적 등급 III 베타 튜룰린 마커를 표현한 다수로 도파민성 뉴런으로 확인되었다. 일방적인 6-hyroxydopamine 병병 마우스 모형의 설치 후에, 행동 평가는 파킨슨 병 현상을 추정하기 위하여 실시되었습니다.
세포 이식을 받은 마우스는 운동 기능에 있는 유의한 개선을 보여주었습니다. 6-hyroxydopamine 유도병변의 정도는 striatum에서 TH에 대한 사후 면역 형광 염색, 내측 전뇌 번들 및 실질적인 니그라 파스 콤팩트에 의해 확인되었다. TH 양성 신호는 세포가 이식되고 또한 SN에서 약간 복구된 striatum에서 크게 복구되었습니다. 이식 후 3개월, 생존 세포 중 약 13.84%가 TH 양성 도파민성 뉴런이었다.
TH 양성 세포의 약 91.72%가 고아 핵 수용체를 표현했으며, 약 86.76%가 FOXA2를 발현했으며, 약 98.77%가 G 단백질 결합 내정류 칼륨과 공동 표지되었다. 밀도 그라데이션 매체에 희석 된 말초 혈액 30 마일을 놓을 때, 그라데이션 인터페이스를 방해하지 않고 천천히 조심스럽게하십시오. 높은 바이러스 활동을 보장하기 위해 센다이 바이러스의 반복 해동 및 동결을 피하기 위해주의해야한다.
말초 혈액 단핵 세포를 유도신경 줄기 세포로 재프로그래밍할 때는 매일 세포의 형태를 면밀히 관찰하십시오. 또한, 6-하이드록시도파민은 빛과 온도에 민감하다. 용액을 빛으로부터 보호하고 사용하기 전에 얼음에 보관하십시오.
이 절차에 따라, 하나는 문화권에서 가족 PD 환자 유래 도파민성 뉴런을 사용하여 질병 메커니즘을 연구할 수 있습니다. 하나는 또한 이식된 세포가 손상된 신경 회로에 어떻게 영향을 미치는지 조사하는 것을 계속할 수 있습니다.
