הערכת הכדאיות תא ומוות ב 3D בתרבויות ספרואיד של תאים סרטניים

הפרוטוקולים המוצגים כאן כבר אופטימיזציה לתרבות 3D ולאפשר חקירה יעילה ובמחיר סביר של תהליכים הקשורים לצמיחה תאים סרטניים, התפשטות, ומוות בסביבה 3D. היתרונות העיקריים של שימוש בתרבות 3D היא כי הם אפשרות ייחודית עבור recapitulating היבטים מרכזיים של microenvironment הגידול במבחנה. 3D spheroid של כלי חשוב עבור הקרנת תרופות לסרטן, אשר משמש יותר ויותר כדי לשפר את התרגום בין במבחנה ו in vivo תנאים במחקר טיפול בסרטן.

חלק מהפרוטוקולים דורשים כמות מסוימת של תרגול ומיומנות. זה נכון במיוחד לייצור כדוריות בשיטת טיפת היד, ולהטבעת כדוריות לאימונוהיסטוכימיה. כמו אלמנטים מרכזיים של הליכים אלה קשה לתאר בכתב, כגון כיצד להכניס כדוריות לתוך טיפה של אגרוז, הדגמה חזותית תסייע לחוקרים לבצע הליכים אלה.

לדלל את ההשעיה התא מוכן בצינור 15 מיליליטר כדי להשיג את צפיפות התא האופטימלית. מעבירים את מתלי התאים המדוללים למאגר סטרילי, ולהשתמש פיפטה רב ערוצית לחלק 200 microliters לתוך הצלחת שהוכן בעבר. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני ו 95% לחות.

כל יומיים עד שלושה ימים, להשיג תמונות מיקרוסקופיות קלות של הכדורואידים. לאחר רכישת התמונות, להסיר 100 microliters של המדיום בילה מכל באר, ולהחליף אותו עם 100 microliters של מדיום טרי. ראשית, להפשיר קרום מרתף מחדש על קרח.

יש לשמור את כל הלוחות והמאגרים העטופים בנפרד על הקרח לפני השימוש. לאחר מכן, לדלל את ההשעיה התא מוכן בצינור 15 מיליליטר כדי להשיג את צפיפות התא האופטימלית. מניחים את הצינור המכיל את המתלה התא מדולל על קרח.

ממלאים את מיכלי הפלסטיק בקרח ומעבירים אותם למכסה המנוע. מעבירים את הצלחות והמאגרים המצונן למכסה המנוע של תרבות התאים. מניחים את הצלחות והמאגרים בחזרה על הקרח.

יש להשתמש מחדש ב-rBM בעדינות כדי להבטיח ג'ל הומוגני. מוסיפים את הריכוז האופטימלי של ה- rBM לתלי התא המצונן. הפוך את הצינור כדי להבטיח כי rBM ומתלים התא מעורבבים כראוי.

לאחר מכן, מעבירים את התערובת למאגר סטרילי, ולהשתמש פיפטה רב ערוצית לחלק 200 microliters לכל באר של צלחת מקורר, אולטרה נמוך מצורף, 96 היטב. צנטריפוגה הצלחת ב 750 פעמים g במשך 15 דקות כדי להבטיח כי התאים מקובצים יחד כאשר rBM מתקשה. השתמש בירידה רכה צנטריפוגה או פונקציית בלימה מינימלית.

ראשית, להוסיף שישה מיליליטר של PBS לצלחת תרבות התא. לדלל את ההשעיה התא מוכן כדי לקבל דילול מתאים. דילול מעשי הוא 50,000 תאים למיליליטר.

יוצקים את ההשעיה התא לתוך מאגר סטרילי ולהשתמש פיפטה רב ערוצית בזהירות למקם עד 30 טיפות של השעיה לתוך המכסה של צלחת תרבות התא, וכתוצאה מכך ריכוז של 2000 תאים לכל טיפה. בתנועה מהירה אך מבוקרת, הפוך את המכסה והצב אותו על גבי צלחת תרבות התא המכילה PBS. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ו 95% לחות במשך ארבעה עד שישה ימים.

אם יש להשתמש בספירואידים לליזטס חלבונים או להטמיע אותם, משוך אותם על ידי הסרת המכסה, הטייתו ולאחר מכן שטיפה של הטיפות עם מיליליטר אחד של מדיה מחוממת. מעבירים את המדיום המכיל כדורית וכתוצאה מכך לצינור 1.5 מיליליטר. תן את הכדור להתיישב לתחתית הצינור לפני שתמשיך עם חלבון lysates או הטבעה.

חותכים את הקצה של קצה פיפטה P200 כדי ללכוד בקלות רבה יותר את הכדורואידים מבלי להפריע למבנה שלהם. עבור כל מצב, למשוך מינימום של 12 אבל באופן אידיאלי בין 18 ל 24 כדורי עופרה בצינור 1.5 מיליליטר. מניחים את הצינורות על קרח ומאפשרים לספרואידים להתיישב בתחתית.

לאחר מכן, לעבור ממעבדת התאים הסטריליים למעבדה הרגילה. לשטוף את הכדורים פעמיים במיליליטר אחד של קרח קר אחד X PBS, הקפדה לתת את הכדורידים להתיישב לפני הסרת PBS בין כל שלב כביסה. לאחר מכן, שאפת PBS ככל האפשר מבלי להפריע או להסיר את כדוריות.

הוסף חמישה microliters של חיץ תזה מחומם עם מעכבי פוספטאז ופרוטאז לכל ספרואיד. מערבולת הכדורים במשך 30 שניות ולאחר מכן לבצע צנטריפוגה מהירה במשך 10 שניות. חזור על מרווחים אלה של מערבולת וצנטריפוגה במשך חמש עד 10 דקות, או עד כדורידים מומסים.

לאחר הכנת פתרון PI, להסיר 100 microliters של בינוני מכל באר בצלחת 96 באר, הקפד לא להסיר את כדוריות. הוסף 100 microliters של מחומם אחד X PBS לכל באר, ואחריו הסרת 100 microliters של נוזל מן בארות. חזור על שלב כביסה זה שלוש פעמים כדי לשטוף את כל המדיום שנותר.

לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטרים של פתרון PI לכל באר. מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום ודגירה במשך 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ו 95% לחות במשך 10 עד 15 דקות. לאחר מכן, חזור על תהליך הכביסה עם אחד מחומם X PBS שלוש פעמים, כפי שתואר קודם לכן, כדי לשטוף את פתרון PI ולצמצם את אות הרקע בעת הדמיה.

באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי, תדמיין את הכדורואידים. בתוך תוכנת ההדמיה, פתח את התפריט הרב-ערוצי. קבעו את זמן החשיפה לערוצים הרלוונטיים, ולחץ על 'הגדרות קריאה' לאחר התאמת כל ערוץ.

פתחו את התפריט 'מחסנית Z' והגדירו את ההתחלה והסיום על-ידי התאמת מוקד התמונה. בתחילה יש את הספרואיד מחוץ לפוקוס, ולאחר מכן להעביר את המוקד דרך הכדור כולו עד התמונה הופכת מטושטשת שוב. לאחר מכן התאימו את גודל הצעד ל-18 עד 35 מיקרומטר, והקש Start.

כדי להתחיל, לתקן את הכדורידים במכסה המנוע אדים ביום הראשון כמתואר בפרוטוקול הטקסט. ביום השני, מניחים את ג'ל אגרוז לתוך מקור מלא מים במיקרוגל כדי לחמם אותו ולשמור את הג'ל חם על צלחת חימום ספסל העליון להגדיר 60 מעלות צלזיוס, עד הצורך. לשטוף את הכדורים פעמיים במכסה המנוע אדים באמצעות מיליליטר אחד של קרח קר אחד X PBS לכל לשטוף.

לאחר מכן, שאף את רוב PBS. הכן קצה פיפטה 20 microliter על ידי חיתוך אותו על שיפוע כדי לקבל קצה פוינטר עם חור גדול יותר. לאחר מכן, לעשות טיפת ג'ל אגרוז על שקופית מיקרוסקופ.

מניחים את המגלשה על בלוק חימום חם כדי למנוע את התגבשות ההתעוררות. באמצעות קצה פיפטה שונה, לתפוס כדוריות רבות ככל האפשר בנפח של 15 עד 20 microliters. בזהירות להזריק את הכדורואידים למרכז טיפת ג'ל אגרוז, הקפד לא לגעת שקופית מיקרוסקופ.

דגירה בטמפרטורת החדר או בארבע מעלות במשך חמש עד 10 דקות כדי לאפשר לג'ל אגרוז לרדת להקשיח. כאשר טיפת הג'ל התגבשה במקצת, אך היא עדיין רכה למדי, השתמש באזמל כדי לדחוף אותו בזהירות מגלשת המיקרוסקופ לתוך קלטת רקמת פלסטיק. מעבירים את קלטת הרקמה לסק מלא באתנול ומאחסנים בטמפרטורת החדר.

במחקר זה, סדרה של שיטות מוצגות לניתוח של שינויים נגד סרטן הנגרמת על ידי טיפול בסרטן הכדאיות ומוות בתרבות 3D. הריכוז של rBM הוסיף יכול להשפיע עמוקות על המורפולוגיה של כדוריות. תוספת של עד 2.5% rBM מאפשרת היווצרות כדורית בתאי סרטן השד SKBr-3, ללא השפעה נוספת בריכוזים גבוהים יותר.

לעומת זאת, BxPC-3 תאים סרטניים בלבלב באופן ספונטני ליצור כדוריות קומפקטיות קטנות. בסוג תא זה, הגדלת ה- rBM ל- 1.5% ומעלה מעוררת שינוי מורפולוגי מובהק מספרואיד למבנים מפותלים יותר עם בלטים והפרעות. דוגמה לשימוש בתרבויות כדוריות להקרנה של יעילות כימותרפיה מוצגת כאן.

תמונות מיקרוסקופ אור נרכשים כל יומיים עד שלושה ימים במהלך ניסוי תגובת מינון שבוצע כדי לקבוע את המינון הדרוש עבור 50% הכדאיות מופחתת בתאי סרטן השד MDA-MB-231. הסידור המרחבי של תאים מתים על ריכוז הולך וגדל של מעכב יכול להיות חזותי באמצעות כתמי PI. כפי שניתן לראות, כדורי בקרה מראים ליבה נמקית מוגבלת, אפופוטוטית מאוחרת, ואילו התאים המתים מופצים ברחבי הכדורואיד ככל שריכוז המעכב גדל.

הטכניקה הכדורית המוצגת כאן יכולה להיות מיושמת על בדיקות רבות אחרות, כגון פלישה תלת מימדית, הגירה או ניתוח מיקרופורטי. זה ישים גם עבור תרבויות שיתוף עם fibroblast, adipocytes, או תאים חיסוניים, אשר יכול לספק מידע חשוב על אינטראקציות הסלולר microenvironment הגידול. הפיתוח של טכניקה זו היה חשוב מאוד בהבהרה את התפקיד של microenvironment הגידול בהיבטים רבים של התפתחות הסרטן, כולל ביטוי גנים, פלישה, וסיוע בטיפול.