Les protocoles présentés ici ont été optimisés pour la culture 3D et permettent une étude efficace et abordable des processus associés à la croissance, à la prolifération et à la mort des cellules cancéreuses dans un environnement 3D. Les principaux avantages de l’utilisation de la culture 3D est qu’ils sont une possibilité unique pour récapituler les aspects clés du microenvironnement tumoral in vitro. Le sphéroïde 3D est un outil important pour le dépistage des médicaments contre le cancer, qui est de plus en plus utilisé pour améliorer la traduction entre les conditions in vitro et in vivo dans la recherche sur le traitement du cancer.
Certains protocoles exigent une certaine pratique et compétence. Ceci est particulièrement vrai pour la production de sphéroïdes par la méthode de goutte à main, et pour l’intégration des sphéroïdes pour l’immunohistochimie. Comme les éléments clés de ces procédures sont difficiles à décrire par écrit, comme la façon d’insérer des sphéroïdes dans une goutte d’agarose, la démonstration visuelle aidera les chercheurs à effectuer ces procédures.
Diluer la suspension cellulaire préparée dans un tube de 15 millilitres pour obtenir la densité cellulaire optimale. Transférez la suspension cellulaire diluée dans un réservoir stérile et utilisez une pipette multicanal pour distribuer 200 microlitres dans la plaque préparée précédemment. Incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone et 95% d’humidité.
Tous les deux à trois jours, acquérir des images microscopiques légères des sphéroïdes. Après l’acquisition des images, retirez 100 microlitres du milieu usé de chaque puits et remplacez-les par 100 microlitres de milieu frais. Premièrement, décongeler la membrane reconstituée du sous-sol sur la glace.
Conservez les plaques et les réservoirs emballés individuellement sur la glace avant de les utiliser. Ensuite, diluer la suspension cellulaire préparée dans un tube de 15 millilitres pour obtenir la densité cellulaire optimale. Placer le tube contenant la suspension cellulaire diluée sur la glace.
Remplissez les contenants en plastique de glace et transférez-les dans le capot. Transférer les plaques réfrigérées et les réservoirs dans une hotte de culture cellulaire. Remettre les assiettes et les réservoirs sur la glace.
Resuspendez doucement le rBM pour assurer un gel homogène. Ajouter la concentration optimale du rBM aux suspensions cellulaires réfrigérées. Inverser le tube pour s’assurer que le rBM et la suspension cellulaire sont correctement mélangés.
Ensuite, transférez ce mélange dans un réservoir stérile et utilisez une pipette multicanal pour distribuer 200 microlitres à chaque puits d’une plaque réfrigérée, ultra-faiblement attachée et de 96 puits. Centrifuger la plaque à 750 fois g pendant 15 minutes pour s’assurer que les cellules sont regroupées lorsque le rBM durcit. Utilisez la descente douce centrifugeuse ou la fonction de freinage minimale.
Tout d’abord, ajouter six millilitres de PBS à un plat de culture cellulaire. Diluer la suspension cellulaire préparée pour obtenir une dilution appropriée. Une dilution pratique est de 50 000 cellules par millilitre.
Verser la suspension cellulaire dans un réservoir stérile et utiliser une pipette multicanal pour placer soigneusement jusqu’à 30 gouttes de suspension dans le couvercle du plat de culture cellulaire, ce qui entraîne une concentration de 2000 cellules par goutte. Dans un mouvement rapide mais contrôlé, inverser le couvercle et le placer sur le dessus du plat de culture cellulaire contenant PBS. Incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone et 95% d’humidité pendant quatre à six jours.
Si les sphéroïdes doivent être utilisés pour les lysates protéiques ou l’intégration, tirez-les en enlevant le couvercle, en l’inclinant, puis en lavant les gouttes avec un millilitre de supports chauffés. Transférer le milieu contenant des sphéroïdes qui en résulte à un tube de 1,5 millilitre. Laissez le sphéroïde s’installer au fond du tube avant de procéder à des lysates protéiques ou à l’intégration.
Coupez l’extrémité d’une pointe de pipette P200 pour capturer plus facilement les sphéroïdes sans perturber leur structure. Pour chaque condition, tirez un minimum de 12 mais idéalement entre 18 et 24 sphéroïdes dans un tube de 1,5 millilitre. Placez les tubes sur la glace et laissez les sphéroïdes s’installer au fond.
Ensuite, passez du laboratoire de cellules stériles au laboratoire régulier. Lavez les sphéroïdes deux fois en un millilitre de glace un X PBS, en s’assurant de laisser les sphéroïdes se déposer avant d’enlever le PBS entre chaque étape de lavage. Ensuite, aspirez autant de PBS que possible sans déranger ou enlever les sphéroïdes.
Ajouter cinq microlitres de tampon de lyse chauffée avec inhibiteurs de la phosphatase et de la protéase par sphéroïde. Vortex les sphéroïdes pendant 30 secondes, puis effectuer une centrifugation rapide pendant 10 secondes. Répétez ces intervalles de vortex et de centrifugation pendant cinq à dix minutes, ou jusqu’à ce que les sphéroïdes soient dissous.
Après avoir préparé la solution PI, retirez 100 microlitres de milieu de chaque puits dans la plaque de 96 puits, en vous assurant de ne pas enlever les sphéroïdes. Ajouter 100 microlitres d’un X PBS chauffé à chaque puits, puis retirer 100 microlitres de liquide des puits. Répétez cette étape de lavage trois fois pour laver tout milieu restant.
Ensuite, ajoutez 100 microlitres de la solution PI à chaque puits. Couvrir la plaque de papier d’aluminium et incuber pendant 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d’humidité pendant 10 à 15 minutes. Après cela, répétez le processus de lavage avec chauffé un X PBS trois fois, comme décrit précédemment, pour laver la solution PI et diminuer le signal de fond lors de l’imagerie.
À l’aide d’un microscope à épifluorescence, imagez les sphéroïdes. Dans le logiciel d’imagerie, ouvrez le menu multicanal. Définissez le temps d’exposition pour les canaux pertinents et appuyez sur Paramètres de lecture après ajustement de chaque canal.
Ouvrez le menu Z-stack et définissez le début et la fin en ajustant la mise au point de l’image. D’abord avoir le sphéroïde hors de discussion, puis déplacer le point focal à travers l’ensemble sphéroïde jusqu’à ce que l’image devient floue une fois de plus. Ajustez ensuite la taille de l’étape pour qu’elle se situe entre 18 et 35 micromètres et appuyez sur Démarrer.
Pour commencer, fixez les sphéroïdes dans une hotte de fumée le premier jour tel que décrit dans le protocole de texte. Le deuxième jour, placer le gel d’agarose dans un bécher rempli d’eau dans un four à micro-ondes pour le chauffer et garder le gel au chaud sur une plaque chauffante fixée à 60 degrés Celsius, jusqu’à ce que nécessaire. Lavez les sphéroïdes deux fois dans le capot des vapeurs à l’aide d’un millilitre de glace par X PBS par lavage.
Ensuite, aspirer la plupart des PBS. Préparez une pointe de pipette de 20 microlitres en la coupant à une inclinaison pour obtenir une pointe plus pointue avec un trou plus grand. Après cela, faire une goutte de gel agarose sur une diapositive microscope.
Placez la lame sur un bloc chauffant chaud pour empêcher l’agarose de se solidifier. À l’aide de la pointe de pipette modifiée, attraper autant de sphéroïdes que possible dans un volume de 15 à 20 microlitres. Injectez soigneusement les sphéroïdes au centre de la goutte de gel agarose, en vous assurant de ne pas toucher la lame du microscope.
Incuber à température ambiante ou à quatre degrés pendant cinq à 10 minutes pour laisser le gel agarose tomber durcir. Lorsque la goutte de gel s’est quelque peu solidifiée, mais qu’elle est encore assez molle, utilisez un scalpel pour le pousser soigneusement de la glissière du microscope dans une cassette de tissu en plastique. Transférer la cassette tissulaire dans un bécher rempli d’éthanol et la conserver à température ambiante.
Dans cette étude, une série de méthodes sont présentées pour l’analyse des changements induits par le traitement anticancéreux dans la viabilité et la mort des cellules cancéreuses dans la culture 3D. La concentration de rBM ajoutée peut affecter profondément la morphologie des sphéroïdes. L’ajout de jusqu’à 2,5%rBM permet la formation de sphéroïdes dans les cellules cancéreuses du sein SKBr-3, sans autre effet à des concentrations plus élevées.
En revanche, les cellules cancéreuses pancréatiques BxPC-3 forment spontanément de petits sphéroïdes compacts. Dans ce type de cellule, l’augmentation du rBM à 1,5% ou plus provoque un changement morphologique distinct de sphéroïdes à des structures plus alambiquées avec des saillies et des invaginations. Un exemple de l’utilisation des cultures sphéroïdes pour le criblage de l’efficacité de chimiothérapie est montré ici.
Les images de microscope léger sont acquises tous les deux à trois jours au cours d’une expérience de réponse à la dose effectuée pour déterminer la dose nécessaire à une viabilité réduite de 50 % dans les cellules cancéreuses du sein MDA-MB-231. L’agencement spatial des cellules mortes lors d’une concentration croissante d’un inhibiteur peut être visualisé à l’aide de taches IP. Comme on le voit, les sphéroïdes de contrôle montrent un noyau apoptotique limité et tardif, tandis que les cellules mortes sont réparties dans tout le sphéroïde à mesure que la concentration d’inhibiteur est augmentée.
La technique sphéroïde montrée ici peut être appliquée à beaucoup d’autres analyses, telles que l’invasion 3D, la migration, ou l’analyse microphoretic. Il est également applicable pour les co-cultures avec le fibroblaste, les adipocytes, ou les cellules immunitaires, qui peuvent fournir des informations importantes sur les interactions cellulaires dans le microenvironnement tumoral. Le développement de cette technique a été très important en élucidant le rôle du microenvironnement de tumeur dans de nombreux aspects du développement de cancer, y compris l’expression de gène, l’invasion, et l’aide de traitement.
