Burada sunulan protokoller 3D kültür için optimize edilmiş ve kanser hücresi büyümesi ile ilişkili süreçlerin verimli ve uygun fiyatlı soruşturma için izin, çoğalma, ve 3D bir ortamda ölüm. 3D kültürünü kullanmanın en önemli avantajları, tümör mikroortamının in vitro temel yönlerini yeniden özetlemek için benzersiz bir olasılık olmasıdır. 3D spheroid kanser ilaç tarama için önemli bir araçtır, giderek kanser tedavisi araştırmainda in vitro ve in vivo koşullar arasında çeviri geliştirmek için kullanılmaktadır.
Protokollerin bazıları belirli bir miktar pratik ve beceri gerektirir. Bu özellikle el damlası yöntemi ile küresel üretmek için doğrudur, ve immünohistokimya için küresel katıştırma için. Bu yordamların temel unsurlarını yazılı olarak açıklamak zor olduğundan, örneğin bir damla agarose'a nasıl spheroidlerin yerleştirilen gibi, görsel gösteri araştırmacıların bu prosedürleri gerçekleştirmelerine yardımcı olacaktır.
En iyi hücre yoğunluğunu elde etmek için hazırlanan hücre süspansiyonu 15 mililitrelik bir tüpte seyreltin. Seyreltilmiş hücre süspansiyonunu steril bir rezervuara aktarın ve önceden hazırlanmış tabağa 200 mikrolitre dağıtmak için çok kanallı pipet kullanın. %5 karbondioksit ve %95 nem oranı ile 37 derecede kuluçkaya yatırın.
Her 2-3 günde bir, küresel lerin hafif mikroskobik görüntülerini elde edin. Görüntüleri aldıktan sonra, harcanan ortamın 100 mikrolitresini her kuyudan çıkarın ve 100 mikrolitre taze ortamla değiştirin. İlk olarak, buz üzerinde yeniden oluşan bodrum zarı çözülme.
Kullanmadan önce ayrı ayrı sarılmış plakaları ve rezervuarları buz üzerinde saklayın. Daha sonra, en iyi hücre yoğunluğuelde etmek için 15 mililitrelik bir tüp içinde hazırlanan hücre süspansiyon seyreltmek. Seyreltilmiş hücre süspansiyonu içeren tüpü buz üzerine yerleştirin.
Plastik kapları buzla doldurun ve kaputa aktarın. Soğutulmuş tabakları ve rezervuarları bir hücre kültürüne aktarın. Plakaları ve rezervuarları tekrar buza koyun.
Homojen bir jel sağlamak için rBM'yi nazikçe yeniden askıya alın. Soğutulmuş hücre süspansiyonlarına rBM'nin optimum konsantrasyonunu ekleyin. rBM ve hücre süspansiyonunun düzgün bir şekilde karıştırıldığından emin olmak için tüpü ters çevirin.
Daha sonra, steril bir rezervuar bu karışımı aktarın ve soğutulmuş, ultra-düşük eki, 96-iyi plaka her kuyuya 200 mikrolitre dağıtmak için çok kanallı pipet kullanın. RBM sertleştiğinde hücrelerin bir araya toplandığından emin olmak için plakayı 750 kez g'de 15 dakika santrifüj edin. Santrifüj yumuşak iniş veya minimal frenleme işlevini kullanın.
İlk olarak, bir hücre kültür çanak PBS altı mililitre ekleyin. Uygun bir seyreltme elde etmek için hazırlanan hücre süspansiyon seyreltmek. Pratik bir seyreltme mililitre başına 50.000 hücredir.
Hücre süspansiyonu steril bir rezervuara dökün ve hücre kültür yemeğinin kapağına 30 damla kadar süspansiyonu dikkatlice yerleştirmek için çok kanallı bir pipet kullanın ve bu da damla başına 2000 hücre konsantrasyonu yla sonuçlanır. Hızlı ama kontrollü bir hareketle, kapağı ters çevirin ve PBS içeren hücre kültürü yemeğinin üzerine yerleştirin. 4-6 gün boyunca %5 karbondioksit ve %95 nem ile 37 derecede kuluçkaya yatırın.
Eğer küresel ler protein lisates veya embedding için kullanılacaksa, kapağı çıkararak, yatırarak ve damlaları bir mililitre ısıtılmış ortamla yıkayarak çekin. Elde edilen küresel içeren ortamı 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Protein lisates veya katıştırma ile devam etmeden önce spheroid tüpün altına yerleşmek sağlar.
P200 pipet ucunu kesilerek küresel leri yapılarını bozmadan daha kolay yakalayın. Her durum için, 1.5 mililitrelik tüp içinde 18 ve 24 küresel ler arasında ideal olarak 12 en az çekin. Buz tüpleri yerleştirin ve küresel lerin alt yerleşmek için izin.
Daha sonra, steril hücre laboratuvarından normal laboratuvara geçin. Her yıkama adımı arasında PBS çıkarmadan önce spheroids yerleşmek emin olun, buz gibi bir x PBS bir mililitre iki kez spheroids yıkayın. Daha sonra, rahatsız edici veya küresel çıkarmadan mümkün olduğunca çok PBS aspire.
Fosfataz ve proteaz inhibitörleri ile beş mikrolitre ısıtılmış lysis tampon ekleyin. Girdap 30 saniye boyunca küresel ve daha sonra 10 saniye için hızlı bir santrifüj gerçekleştirin. Bu girdap ve santrifüj aralıklarını beş ila 10 dakika veya küresel ler eriyene kadar tekrarlayın.
PI çözeltisini hazırladıktan sonra, 96 kuyulu plakadaki her kuyudan 100 mikrolitre orta yıkın ve küresel leri çıkarmamaya özenin. Her kuyuya 100 mikrolitre ısıtılmış bir X PBS ekleyin ve ardından kuyulardan 100 mikrolitre sıvı çıkarTın. Kalan orta yıkayın için bu yıkama adımÜç kez tekrarlayın.
Ardından, her kuyuya 100 mikrolitre PI çözeltisi ekleyin. Plakayı alüminyum folyo ile kaplayın ve %5 karbondioksit ve %95 nem oranıyla 37 santigrat derece 10 ila 15 dakika kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, PI çözeltisini yıkamak ve görüntüleme yaparken arka plan sinyalini azaltmak için, daha önce açıklandığı gibi, ısıtılmış bir X PBS ile yıkama işlemini üç kez tekrarlayın.
Epifloresan mikroskobu kullanarak, küresel leri görüntüle. Görüntüleme yazılımı içinde, çok kanallı menüyü açın. İlgili kanalların pozlama süresini ayarlayın ve her kanalı ayarladıktan sonra Okuma Ayarları'na basın.
Z yığını menüsünü açın ve görüntü odağı ayarlayarak başlangıç ve bitişi tanımlayın. Başlangıçta odak dışında küresel var, daha sonra görüntü bir kez daha bulanık hale gelene kadar tüm küresel boyunca odak noktası hareket ettirin. Ardından adım boyutunu 18 ila 35 mikrometre arasında ayarlayın ve Başlat tuşuna basın.
Başlamak için, metin protokolünde belirtildiği gibi ilk gün duman kaputunda küresel leri düzeltin. İkinci gün, agarose jeli mikrodalga fırında su dolu bir kabın içine yerleştirin ve jeli 60 dereceye kadar bir banküstü ısıtma plakasında sıcak tutun. Her bir mililitre buz gibi bir X PBS kullanarak duman kaputunda iki kez sferoidleri yıkayın.
Sonra, PBS en aspire. Daha büyük bir delik ile sivri bir ucu elde etmek için bir eğim de keserek 20 mikrolitrelik pipet ucu hazırlayın. Bundan sonra, bir mikroskop slayt üzerinde bir agarose jel damla olun.
Agarose katılaşmasını önlemek için sıcak bir ısıtma bloğu üzerine slayt yerleştirin. Modifiye pipet ucunu kullanarak, 15 ila 20 mikrolitrelik bir hacimde mümkün olduğunca çok küresel madde yakalayın. Mikroskop kaydırağını dokunmamak için küresel leri agarose jel damlasının ortasına dikkatlice enjekte edin.
Oda sıcaklığında veya dört derecede beş ila 10 dakika agarose jel sertleşmek için inkübate. Jel damla biraz katılaşmış olduğunda, ama yine de oldukça yumuşak, dikkatle plastik bir doku kasetiçine mikroskop slayt itmek için bir neşter kullanın. Doku kasetini etanol dolu bir kabına aktarın ve oda sıcaklığında saklayın.
Bu çalışmada, 3D kültürde kanser hücresi canlılığı ve ölüm anti-kanser tedavisine bağlı değişikliklerin analizi için bir dizi yöntem sunulmuştur. Eklenen rBM konsantrasyonu küresellerin morfolojisini derinden etkileyebilir. %2.5'e kadar rBM eklenmesi, SKBr-3 meme kanseri hücrelerinde küresel oluşumuna izin verir ve daha yüksek konsantrasyonlarda başka bir etki yoktur.
Buna karşılık, BxPC-3 pankreas kanseri hücreleri kendiliğinden küçük kompakt sheroidler oluşturur. Bu hücre tipinde rBM'nin %1.5 veya üzerinde arttırılması, spheroid'den çıkıntılı ve invaginsi olan daha kıvrımlı yapılara farklı bir morfolojik değişim sağlar. Kemoterapi etkinliğinin taranması için küresel kültürlerin kullanımına bir örnek burada gösterilmiştir.
MDA-MB-231 meme kanseri hücrelerinde %50 azaltılmış canlılık için gerekli dozu belirlemek için yapılan bir doz yanıt deneyi sırasında ışık mikroskop görüntüleri her iki ila üç günde bir elde edilir. Ölü hücrelerin bir inhibitör konsantrasyonu üzerine mekansal düzenleme PI boyama kullanılarak görselleştirilmiş olabilir. Görüldüğü gibi, kontrol spheroidler sınırlı nekrotik göstermek, geç apoptotik çekirdek, ölü hücreler inhibitör konsantrasyonu arttıkça küresel boyunca dağıtılır ise.
Burada gösterilen küresel teknik, 3D invazyon, göç veya mikroforetik analiz gibi diğer birçok teste uygulanabilir. Ayrıca fibroblast, adipositler veya bağışıklık hücreleri ile ortak kültürler için de geçerlidir, hangi tümör mikroortamda hücresel etkileşimler hakkında önemli bilgiler sağlayabilir. Bu tekniğin gelişimi, gen ekspresyonu, invazyon ve tedavi yardımı da dahil olmak üzere, kanser gelişiminin çeşitli yönlerinde tümör mikroortamının rolünün aydınlatIlmesinde çok önemli olmuştur.
