وقد تم تحسين البروتوكولات المقدمة هنا لثقافة 3D والسماح للتحقيق بكفاءة وبأسعار معقولة من العمليات المرتبطة نمو الخلايا السرطانية، والانتشار، والموت في بيئة 3D. المزايا الرئيسية لاستخدام ثقافة 3D هو أنها إمكانية فريدة من نوعها لتلخيص الجوانب الرئيسية للورم microenvironment في المختبر. 3D spheroid أداة هامة لفحص أدوية السرطان، والتي تستخدم على نحو متزايد لتحسين الترجمة بين في المختبر وفي ظروف الجسم الحي في أبحاث علاج السرطان.
بعض البروتوكولات تتطلب قدرا معينا من الممارسة والمهارة. هذا ينطبق بشكل خاص لإنتاج الزفيرويدات بواسطة طريقة قطرة اليد ، و تضمين الزفيرويدات للكيمياء المناعية. كما العناصر الرئيسية لهذه الإجراءات من الصعب وصفها في الكتابة، مثل كيفية إدراج الزفوئيات في قطرة من agarose، سوف تساعد مظاهرة بصرية الباحثين على تنفيذ هذه الإجراءات.
تخفيف تعليق الخلية المعدة في أنبوب 15 ملليلتر للحصول على كثافة الخلايا المثلى. نقل تعليق الخلية المخففة إلى خزان معقمة، واستخدام ماصة متعددة القنوات للاستغناء عن 200 ميكرولترات في لوحة أعدت سابقا. احتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون والرطوبة 95٪.
كل يومين إلى ثلاثة أيام، الحصول على صور مجهرية خفيفة من spheroids. بعد الحصول على الصور، وإزالة 100 ميكرولترات من المتوسط المستهلك من كل بئر، واستبدالها مع 100 ميكرولترات من المتوسطة الطازجة. أولاً، ذوبان غشاء الطابق السفلي المعاد تشكيله على الجليد.
الحفاظ على أي لوحات ملفوفة بشكل فردي والخزانات على الجليد قبل الاستخدام. بعد ذلك، قم بتخفيف تعليق الخلايا المعدة في أنبوب 15 ملليلتر للحصول على كثافة الخلايا المثلى. ضع الأنبوب الذي يحتوي على تعليق الخلية المخفف على الجليد.
املأ الحاويات البلاستيكية بالثلج ونقلها إلى غطاء محرك السيارة. نقل اللوحات المبردة والخزانات إلى غطاء لثقافة الخلية. ضع الصفائح والخزانات مرة أخرى على الجليد.
Resuspend rBM بلطف لضمان هلام متجانسة. أضف التركيز الأمثل للrBM إلى تعليق الخلايا المبردة. عكس أنبوب لضمان أن rBM وتعليق الخلية مختلطة بشكل صحيح.
ثم، نقل هذا الخليط إلى خزان معقمة، واستخدام ماصة متعددة القنوات لتوزيع 200 ميكرولترات إلى كل بئر من المبردة، ومرفق فائقة منخفضة، 96-جيدا لوحة. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 750 مرات ز لمدة 15 دقيقة لضمان أن الخلايا تتجمع معا عندما تصلب rBM. استخدام هبوط جهاز الطرد المركزي لينة أو الحد الأدنى وظيفة الكبح.
أولاً، أضف ستة ملليلترات من برنامج تلفزيوني إلى طبق ثقافة الخلية. تخفيف تعليق الخلية المعدة للحصول على تخفيف مناسبة. التخفيف العملي هو 50،000 خلية لكل ملليلتر.
صب تعليق الخلية في خزان معقمة واستخدام ماصة متعددة القنوات لوضع بعناية ما يصل إلى 30 قطرات من التعليق في غطاء طبق ثقافة الخلية، مما أدى إلى تركيز 2000 خلية لكل قطرة. في حركة سريعة ولكن تسيطر عليها، عكس الغطاء ووضعها على رأس طبق ثقافة الخلية التي تحتوي على برنامج تلفزيوني. احتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون والرطوبة 95٪لمدة أربعة إلى ستة أيام.
إذا كان سيتم استخدام الـ spheroids للبروتين أو التضمين ، فقم بسحبها عن طريق إزالة الغطاء ، وإمالةه ، ثم غسل القطرات بميليلتر واحد من الوسائط الساخنة. نقل المتوسط الذي يحتوي على الزفير الناتج إلى أنبوب 1.5 ملليلتر. السماح للpheroid تسوية إلى الجزء السفلي من الأنبوب قبل المضي قدما مع lysates البروتين أو تضمين.
قطع نهاية تلميح P200 ماصة لالتقاط أكثر سهولة spheroids دون إزعاج هيكلها. لكل حالة، سحب الحد الأدنى من 12 ولكن من الناحية المثالية بين 18 و 24 spheroids في أنبوب 1.5 ملليلتر. ضع الأنابيب على الجليد والسماح للsoidoids لتسوية في الجزء السفلي.
بعد ذلك، انتقل من مختبر الخلايا العقيمة إلى المختبر العادي. غسل spheroids مرتين في ملليلتر واحد من الجليد الباردة واحد X برنامج تلفزيوني، والتأكد من السماح للpheroids تسوية قبل إزالة برنامج تلفزيوني بين كل خطوة الغسيل. ثم، التعرق قدر برنامج تلفزيوني ممكن دون إزعاج أو إزالة الزفيرويدات.
إضافة خمسة microliters من عازلة تحلل ساخنة مع فوسفاتاز ومثبطات البروتياز في spheroid. دوامة spheroids لمدة 30 ثانية ثم قم بتنفيذ طرد سريع لمدة 10 ثوان. كرر هذه الفواصل الزمنية من دوامة والطرد المركزي لمدة خمس إلى 10 دقائق، أو حتى يتم حل الـ spheroids.
بعد إعداد حل PI، قم بإزالة 100 ميكرولترات من المتوسط من كل بئر في لوحة 96-well، مع التأكد من عدم إزالة الـ spheroids. إضافة 100 ميكرولترات من ساخنة واحدة X برنامج تلفزيوني لكل بئر، تليها إزالة 100 ميكرولترات من السائل من الآبار. كرر هذه الخطوة غسل ثلاث مرات لغسل أي المتوسطة المتبقية.
بعد ذلك، إضافة 100 ميكرولترات من حل PI لكل بئر. تغطية لوحة في رقائق الألومنيوم واحتضان لمدة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون والرطوبة 95٪ لمدة 10 إلى 15 دقيقة. بعد ذلك، كرر عملية الغسيل مع ساخنة X PBS ثلاث مرات، كما هو موضح سابقا، لغسل حل PI وتقليل إشارة الخلفية عند التصوير.
باستخدام مجهر epifluorescence ، صورة spheroids. داخل برنامج التصوير، افتح القائمة متعددة القنوات. حدد وقت التعرض للقنوات ذات الصلة، واضغط على "قراءة الإعدادات" بعد ضبط كل قناة.
افتح قائمة Z-stack وحدد البداية والنهاية عن طريق ضبط تركيز الصورة. في البداية يكون spheroid من التركيز ، ثم نقل نقطة التنسيق من خلال كامل spheroid حتى تصبح الصورة ضبابية مرة أخرى. ثم اضبط حجم الخطوة ليكون بين 18 إلى 35 ميكرومتر، ثم اضغط على ابدأ.
للبدء، قم بإصلاح الـ spheroids في غطاء أبخرة في اليوم الأول كما هو موضح في بروتوكول النص. في اليوم الثاني، ضع جل الأاروز في حانة مملوءة بالماء في فرن ميكروويف لتسخينه والحفاظ على الهلام دافئًا على لوحة تدفئة بأعلى مقاعد البدلاء تم تعيينها إلى 60 درجة مئوية، حتى الحاجة. غسل spheroids مرتين في غطاء الدخان باستخدام ملليلتر واحد من الجليد الباردة واحد X PBS لكل غسل.
ثم، الطامح معظم برنامج تلفزيوني. إعداد 20 طرف ماصة ميكروليت عن طريق قطع عليه في منحدر للحصول على طرف أكثر pointier مع حفرة أكبر. بعد هذا، جعل جل agarose قطرة على شريحة المجهر.
ضع الشريحة على كتلة التدفئة الدافئة لمنع agarose من ترسيخ. باستخدام تلميح ماصة معدلة، الصيد أكبر عدد ممكن من spheroids في حجم من 15 إلى 20 ميكرولترات. حقن بعناية spheroids في وسط قطرة هلام agarose، والتأكد من عدم لمس الشريحة المجهر.
احتضان في درجة حرارة الغرفة أو في أربع درجات لمدة خمس إلى 10 دقائق للسماح هلام agarose قطرة تصلب. عندما تتوطد قطرة هلام إلى حد ما، ولكن لا يزال لينة إلى حد ما، واستخدام مشرط لدفع بعناية من شريحة المجهر في كاسيت الأنسجة البلاستيكية. نقل كاسيت الأنسجة إلى القارم مليئة الإيثانول وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
في هذه الدراسة، يتم عرض سلسلة من الأساليب لتحليل التغيرات الناجمة عن العلاج المضاد للسرطان في قابلية الخلية السرطانية للحياة والوفاة في الثقافة ثلاثية الأبعاد. تركيز rBM المضافة يمكن أن تؤثر تأثيرا عميقا على مورفولوجيا الزاوي. إضافة ما يصل إلى 2.5٪ rBM يسمح تشكيل spheroid في خلايا سرطان الثدي SKBr-3, مع عدم وجود تأثير آخر في تركيزات أعلى.
في المقابل, BxPC-3 خلايا سرطان البنكرياس تشكل تلقائيا spheroids صغيرة الحجم. في هذا النوع من الخلايا، وزيادة rBM إلى 1.5٪ أو أعلى يثير تغيراً مورفولوجياً متميزاً من الهياكل الشفائية إلى الهياكل الأكثر التواءًا مع النتوءات والتلميحات. مثال على استخدام الثقافات spheroid لفحص فعالية العلاج الكيميائي هو مبين هنا.
يتم الحصول على صور المجهر الخفيفة كل يومين إلى ثلاثة أيام خلال تجربة استجابة الجرعة التي يتم تنفيذها لتحديد الجرعة اللازمة لـ 50٪ انخفاض الجدوى في خلايا سرطان الثدي MDA-MB-231. يمكن تصور الترتيب المكاني للخلايا الميتة عند زيادة تركيز المانع باستخدام تلطيخ PI. كما رأينا ، تظهر اللولبيات التحكمية نواة موتوية محدودة ، متأخرة ، في حين يتم توزيع الخلايا الميتة في جميع أنحاء الرفو عندما يزداد تركيز المانع.
يمكن تطبيق تقنية الزفيرة الموضحة هنا على العديد من المقايسات الأخرى، مثل الغزو ثلاثي الأبعاد أو الهجرة أو التحليلات الصغرية. كما أنها تنطبق على الثقافات المشتركة مع الخلايا الليفية، adipocytes، أو الخلايا المناعية، والتي يمكن أن توفر معلومات هامة حول التفاعلات الخلوية في البيئة الدقيقة الورم. وقد تطور هذه التقنية مهمة جدا في توضيح دور البيئة الدقيقة الورم في جوانب عديدة من تطور السرطان, بما في ذلك التعبير الجيني, غزو, والمساعدة في العلاج.
