此处介绍的协议已针对 3D 培养进行了优化，并允许对 3D 环境中与癌细胞生长、增殖和死亡相关的过程进行高效且经济实惠的调查。使用3D培养的主要优点是，它们是在体外重述肿瘤微环境的关键方面的独特可能性。3D球体是癌症药物筛选的重要工具，在癌症治疗研究中，它正越来越多地用于改善体外和体内条件之间的翻译。
有些协议需要一定的练习和技能。这尤其适合通过手滴法生产球体，以及嵌入球体用于免疫组织化学。由于这些程序的关键要素很难以书面形式描述，例如如何将球体插入一滴黄糖中，视觉演示将帮助研究人员执行这些程序。
在15毫升管中稀释准备好的细胞悬浮液，以获得最佳的细胞密度。将稀释的电池悬浮液转移到无菌储液罐中，并使用多通道移液器将 200 微升液分配到先前准备的板中。在37摄氏度下孵育，二氧化碳含量为5%，湿度为95%。
每两到三天，获得球体的光微观图像。获取图像后，从每一个井中去除 100 微升的已用介质，然后用 100 微升的新鲜介质替换。首先，解冻重建冰面的地下室膜。
使用前，请将任何单独包装的板和储层放在冰上。接下来，在15毫升管中稀释准备好的细胞悬浮液，以获得最佳的细胞密度。将含有稀释细胞悬浮液的管子放在冰上。
将塑料容器装满冰，然后将其转移到发动机罩中。将冷却板和储液罐转移到细胞培养罩中。将盘子和储层放回冰上。
轻轻重新暂停 rBM，以确保均匀的凝胶。将 rBM 的最佳浓度添加到冷冻细胞悬浮液中。反转管，确保正确混合 rBM 和电池悬架。
然后，将这种混合物转移到无菌储液罐中，并使用多通道移液器将 200 微升分配到冷却、超低附着、96 井板的每个井中。将板以 750 倍 g 离心 15 分钟，以确保当 rBM 硬化时，电池聚集在一起。使用离心机软下降或最小制动功能。
首先，在细胞培养皿中加入六毫升PBS。稀释准备好的细胞悬浮液以获得合适的稀释。实际稀释是每毫升5万个细胞。
将细胞悬浮液倒入无菌储液罐中，并使用多通道移液器小心地将多达 30 滴悬浮液放入细胞培养皿的盖子中，每滴细胞浓度为 2000 个细胞。在快速但可控的移动中，反转盖子，并放在含有PBS的细胞培养盘的顶部。在37摄氏度下孵育，5%的二氧化碳和95%的湿度，为期4至6天。
如果要将球体用于蛋白质回化或嵌入，请通过取下盖子、倾斜它，然后用一毫升加热介质冲刷滴。将产生的含球状介质转移到 1.5 毫升管。在继续蛋白落酸或嵌入之前，让球体沉淀到管的底部。
切开 P200 移液器尖端的末端，以便更轻松地捕获球体，而不会干扰其结构。对于每种情况，在1.5毫升管中拉至少12个球体，但理想情况下是18至24个球体之间。将管子放在冰上，让球体在底部沉淀。
接下来，从无菌细胞实验室转到常规实验室。在一毫升的冰冷一个X PBS中清洗球类两次，确保让球体在每次洗涤步骤之间去除PBS之前沉淀。然后，吸气尽可能多的PBS，而不干扰或移除球体。
每球体添加五升加热解液缓冲液，加入磷酸酶和蛋白酶抑制剂。旋转球类30秒，然后执行10秒的快速离心。重复这些涡流和离心间隔 5 到 10 分钟，或直到球体溶解。
准备 PI 溶液后，从 96 井板中的每一个井中去除 100 微升介质，确保不去除球体。在每个油井中加入 100 微升加热 X PBS，然后从油井中去除 100 微升液体。重复此洗涤步骤三次以洗掉任何剩余的介质。
接下来，向每井添加 100 微升 PI 解决方案。用铝箔覆盖板，用5%的二氧化碳和95%的湿度孵育37摄氏度，10至15分钟。在此之后，重复洗涤过程与加热一个X PBS三次，如前所述，洗掉PI溶液，并减少成像时的背景信号。
使用荧光显微镜对球体进行成像。在成像软件中，打开多通道菜单。设置相关通道的曝光时间，并在调整每个通道后按"读取设置"。
打开 Z 堆栈菜单，通过调整图像焦点来定义开始和结束。最初让球体离开焦点，然后在整个球体中移动焦点，直到图像再次变得模糊。然后调整步长为 18 到 35 微米，然后按"开始"。
首先，在第一天将球体修复在烟罩中，如文本协议中所述。第二天，将阿加罗斯凝胶放入微波炉中充满水的烧杯中加热，并在台面加热板上将凝胶加热至60摄氏度，直到需要。每次洗一毫升冰冷一个 X PBS 在烟罩中清洗球体两次。
然后，吸气大部分的PBS。准备一个20微升移液器尖端，在斜坡上切割它，以获得一个较大的孔的尖尖。在此之后，在显微镜幻灯片上放置一个阿加罗斯凝胶。
将滑梯放在加热块上，以防止加糖凝固。使用经过修改的移液器尖端，在 15 到 20 微升的体积中捕获尽可能多的球体。小心地将球体注入阿加罗斯凝胶滴的中心，确保不要触摸显微镜幻灯片。
在室温或4度下孵育5至10分钟，让阿加罗斯凝胶下降硬化。当凝胶滴已经凝固一些，但仍然相当柔软，使用手术刀小心地推它从显微镜滑入塑料纸巾盒。将纸巾盒转移到装满乙醇的烧杯中，并在室温下储存。
本研究提出了一系列方法，用于分析三维培养中癌细胞活力和死亡的抗癌治疗诱发变化。添加的rBM浓度可以深刻地影响球体的形态。增加高达2.5%rBM后，SKBr-3乳腺癌细胞中可以形成球状，在较高浓度下不会产生进一步的影响。
相比之下，BxPC-3胰腺癌细胞自发地形成小紧凑的球状体。在此细胞类型中，将 rBM 增加至 1.5% 或以上会引发从球体到更复杂、具有突起和内层的结构的显著形态变化。此处显示了使用球形培养物来筛选化疗疗效的示例。
在进行剂量响应实验期间，每两到三天获取一次光学显微镜图像，以确定 MDA-MB-231 乳腺癌细胞中 50% 降低生存能力所需的剂量。使用 PI 染色，可以可视化在抑制剂浓度增加时死细胞的空间排列。如见，控制球体显示有限的坏死，后期凋亡核，而死细胞分布在整个球体，因为抑制剂的浓度增加。
此处显示的球体技术可应用于许多其他分析，如 3D 入侵、迁移或微泳分析。它也适用于与成纤维细胞、脂肪细胞或免疫细胞的共培养物，它可以提供有关肿瘤微环境细胞相互作用的重要信息。这项技术的发展对于阐明肿瘤微环境在癌症发展的许多方面，包括基因表达、入侵和治疗辅助等都非常重要。
