הפרוטוקול שלנו מתאר שיטות לביטוי וטיהור יעילים של תחום FAH המכיל חלבונים אך גם חלבונים באופן כללי. חלבון FHD-1 ממלא תפקיד רגולטורי במחזור TCA ובחילוף החומרים האנמרץ של המיטוכונדריה. הצלחנו לקשר את ירידה ב-FHD-1 לחוש התאים ומידע על פעילות אנזימים ומבנה חלבונים נדרשים בדרך כלל על מנת להבין מנגנונים מולקולריים מאחורי פנוטיפים שנצפו.
היתרון העיקרי של הבעת חלבונים באמצעות מערכות וקטוריות בלתי ניתנות לחיסון IPTG הוא שכל השיטות זולות יחסית וקלות להקמה בכל מעבדה. על ידי שימוש בחלבונים מסוג פולי-היסטידין בשילוב עם שרף אגרוז ניקל NTA, הבחירה העצומה של כרומטוגרפיה זיקה עשוי להיות מועסק בעלות נמוכה. לרוב המטרות, חלבון המתקבל באיכות זו עשוי כבר להספיק.
FPLC על הידיים האחרות, היא שיטה מבוססת היטב כללית עם מספר יתרונות בהשוואה לשיטות אחרות. ראשית, להכניס חמישה עד 10 ננוגרם של פלסמיד לתוך 100 microliters של מוכשר BL21-DE3 pLysS E.coli חיידקים על קרח. הקש מעט על הצינור כדי לערבב את התוכן.
שמור את החיידקים על קרח במשך 30 דקות, בעדינות הקשה על הצינור כל כמה דקות. מחממים שייקר תרמו ל 42 מעלות צלזיוס. מניחים את הצינור המכיל את החיידקים ב מכשיר וחום במשך 90 שניות.
לאחר מכן, מניחים את הצינור על קרח מיד. לאחר חמש עד 10 דקות על קרח, מוסיפים 600 מיקרוליטרים של מדיום NZCYM וממקמים את הצינור לתוך אינקובטור חיידקים. לנער את הצינור במהירות בינונית בכיוון הרעידות ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.
לאחר הדגירה, צלחת 200 microliters של התרבות החיידקית על צלחת אגר LB 10 ס"מ המכיל את אנטיביוטיקה הבחירה של בחירה. תרבות החיידקים על צלחת אגר LB באינקובטור החיידקים ב 37 מעלות צלזיוס לילה. לאחר היווצרות מושבה מוצלחת, לבחור מושבה אחת בודדת ולפזר אותו בחמישה מיליליטר של NZCYM עם אנטיביוטיקה שנבחרה.
תרבות באינקובטור החיידקים ב 37 מעלות צלזיוס לילה. לאחר צמיחה חיידקית מוצלחת, להגביר את החיידקים ב 250 מיליליטר, 500 מיליליטר או אחד ליטר אצוות של מדיום בהתאם לביקוש של כמות החלבון. לאחר מכן, תרבו את החיידקים, באינקובטור החיידקים ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים עד שלוש שעות.
לאחר הדגירה, צייר מדגם לניתוח פוטומטרי. אם הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר הגיע 0.4, להחיל 200 micromolar עד מילימטר אחד של isopropyl-בטא-D-thiogalactopyranosid. לאחר שלוש עד חמש שעות נוספות באינקובטור החיידקים ב 37 מעלות צלזיוס ביטוי חלבון הוא מותש.
לקצור את גלולת חיידקי באמצעות צנטריפוגה ב 5, 000 פעמים G במשך חמש דקות. לאחר מכן, להשליך את supernatant ולהקפיא את גלולה במינוס 20 מעלות צלזיוס לאחסון קצר. עבור כל 250 מיליליטר של השעיה חיידקית מקורית, להחיל חמישה מיליליטר של המאגר שנבחר על גלולה חיידקית.
הוסף 10 מיקרוליטרים של בטא-mercaptoethanol לכל חמישה מיליליטר של מאגר מיושם. השתמש צינור פסטר 10 מיליליטר כדי לכפות מכנית את גלולה לתוך ההשעיה על ידי גירוד צינורות. להעביר את כל ההשעיה לצינור 50 מיליליטר.
ואז sonicate ההשעיה. לאחר מכן, צנטריפוגה במשך 30 דקות במהירות גבוהה בארבע מעלות צלזיוס. סנן את העל-טבעי ברצף עם יחידות סינון על קרח.
הכן עמוד פלסטיק או זכוכית ריק על-ידי חיבורו לתגוח יציב וכביסה עם חיץ ריצה של ניקל NTA. עבור כל 10 מיליליטר של השעיית חלבון להחיל 500 microliters של ניקל NTA agarose תרחיף על הטור. מלא את העמודה לחלוטין עם ניקל NTA פועל חיץ להבטיח לא לשבש את שרף agarose ולאפשר את המאגר לרוץ דרך כוח הכבידה.
לאחר מכן, להחיל את ההשעיה חלבון על העמודה ולאפשר את המדגם לרוץ דרך על ידי כוח הכבידה. לאחר שהדגימה עברה, מלא את העמודה במאגר פועל NTA ניקל. מניחים קובט שקוף UV מתחת לעמודה ולאסוף מיליליטר אחד של חיץ אלוטיון ניקל NTA.
בדוק את הצפיפות האופטית של המדגם ב 280 ננומטר לעומת מדגם ריק. באופן אופטימלי, המדגם מציג צפיפות אופטית של יותר מ- 2.5. מאז חלבוני FAHD וחוצץ אלוטיון NTA ניקל יהיה לזרז על הקפאה והפשרה, דיאליזה החלבון נגד חיץ אחר לילה על הקרח באמצעות מיקרוליטר אחד של DTT לכל 100 מיליליטר של חיץ דיאליזה.
הגדר מערכת FPLC ולשטוף את העמודה עם חמישה כרכים עמודה של 20%אתנול ואחריו חמישה כרכים עמודה של מים. לאחר שיווי המשקל של העמודה, החל את הדגימה הדיאליזה על העמודה ואסוף את הזרימה. הגדר אלוט הדרגתי.
לאחר סיום מעבר הצבע, הפעל עם מאגר מלח גבוה עד שלא יזהו פסגות נוספות בטווח של אמצעי אחסון של עמודה אחת. התחל קורא מיקרו-צלחת וצלילה במשך 30 דקות ב 25 מעלות צלזיוס. הכן מיליליטר אחד של פתרון 20 מילימולר של מצע להיבדק במאגר מבדיקה אנזים.
על פי ערכת pipetting בפרוטוקול הטקסט, להכין את האנזים ריק לדגום בארות על ידי pipetting 90 microliters של מאגר הבדיקה אנזים לתוך הבאר עם חמישה microliters של פתרון אנזים. לאחר מכן הכינו את המצע ריק ודגמו בארות על ידי צינורות 95 מיקרוליטרים של מאגר בדיקה אנזימים לתוך בארות. ממש לפני המדידה, יש למרוח חמישה מיקרוליטרים של מאגר בדיקות אנזימים על שש בארות ריקות.
החל חמישה microliters של פתרון מצע 20 מילימולר על בארות מדגם. השתמשו בצינור רב-ערוצי בהגדרת 50 מיקרוליטר כדי לערבב בעדינות את בארות. לאחר מכן, הכנס את הלוחית לקורא המיקרו-לוח ולמדוד כל באר ב 255 ננומטר.
לבסוף, בצע את הניתוח בגיליון אלקטרוני. שתי דוגמאות LB צלחות אגר לאחר טרנספורמציה אופטימלית ולא אופטימלית מתוארים כאן. יותר מדי מושבות חיידקים מצביעות על כך ששני חיידקים רבים היו מצופים או שפג תוקפם של האנטיביוטיקה.
מעט מדי מושבות חיידקים עשויות להצביע על כך שלא נעשה מספיק פלסמיד לשינוי או שיותר מדי אנטיביוטיקה שימשה לבחירת החיידקים. גלולה חיידקי המכיל את החלבון לידי ביטוי בכמויות מיליגרם נקצר ביטוי מאומת באמצעות SDS-page. בעיות מסוימות עלולות להתרחש במהלך תהליך פשוט זה, כולל החלבונים ויוצרים גופי הכללה או החלבון לא בא לידי ביטוי.
אם תג שלו משמש כדי לתייג את החלבון, כרומטוגרפיה זיקה עם ניקל NTA אגרוז היא שיטת לכידה קלה וזולה ביטול רוב הזיהומים. אם לא נעשה שימוש בתג, שילוב של משקעים אמוניום גופרתי וכרומטוגרפיה של חילופי הידרופוביים עוקבים עשוי גם להפריד את החלבון מרוב החלבונים האחרים. החלבון מופרד עוד יותר משאריות זיהומים על ידי כרומטוגרפיה חילופי יון ואחריו כרומטוגרפיה הדרת גודל כדי להשיג חלבון טהור מספיק.
אף אחת מהשיטות המתוארות אינה קשה במיוחד. אבל כל השיטות דורשות הכשרה. ניסיונות ראשונים עלולים להיכשל אך הניסויים יצליחו לאחר כמה התאמות נוספות.
כל השיטות המוצגות כאן הן שיטות כלליות לטיהור חלבונים. למרות שהתמחה בחלבוני FAHD, הפרוטוקול עשוי להיות מותאם לכל חלבון אחד רוצה לטהר. FAHD-1 אנושי רקומביננטי הושג על ידי השיטות המתוארות ומבנים רנטגן ברזולוציה גבוהה תרמו באופן מסיבי להבנתנו של FAHD-1 על ידי פונקציונליות מתנהג כמו שניהם, decarboxylase ו hydrolase.
חיידקים המשמשים בעבודה זו הם זני בטיחות ולא מסוכנים. מדריכי בטיחות כלליים חלים על כל הכימיקלים ועמודות FPLC יש לטפל בזהירות.
