כיתה 1 histone deacetylases כמו RpdA נידונים כיתרים חדשניים פוטנציאליים לטיפול בזיהומים פטרייתיים. עם זאת, פעילויות אנזים מטוהרים נדרשים לאפיון נוסף. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא ההפרדה המהירה והמספיקה של קומפלקסים מקוריים המתויגים על-ידי TAP לצורך קביעת פעילות בשלב אחד.
קומפלקסים HDAC נגזר פרוטוקול זה עשוי לשמש להקרנת יעילות של מעכבי deactylase פטרייתי ספציפיים רומן. שיטה זו מספקת את הבסיס לחילוץ וטיהור של חלבונים פטרייתיים מתויגים TAP, אשר עשוי לשמש כנקודת מוצא להקמת פרוטוקולים עבור אנזימים וזנים אחרים. כדי להתחיל בהליך זה, להוסיף 10 מיליליטר של CSS לכל בקבוק של conidia מוכן.
סגרו היטב כל בקבוקון עם מכסה הבורג שסופק ונערו במרץ. לאחר מכן, השתמש בלולאת חיסון סטרילית כדי לגרד לחלוטין את כל conidia הנותרים. מעבירים את הקונידיה דרך מסנני תאים של 40 מיקרומטר המונחים על צינור צנטריפוגה ואוסף את ההשעיה מחמישה בקבוקונים לצינור אחד.
לאחר מכן צנטריפוגה הדגימות לשלב ולדלל את הדגימות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. במקום הראשון גבינה לתוך משפך על גבי בקבוקון. מסננים את המיקליה המוכנה דרך הבד ושוטפים בקצרה במים שעברו דה-מיון.
הסר לחות רבה ככל האפשר מן המיזליה על ידי סחיטת הגבינה בין הידיים רק ולאחר מכן בין מגבות נייר. לאחר מכן, להעביר את המסליה מיובש כמו סדינים שטוחים לתוך פלסטיק עם מכסה בורג. באמצעות חנקן נוזלי, פלאש להקפיא את המיצליה ולאחסן אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס לפני ליופיליזציה.
ואז ליופיל את המיזליה בן לילה. למחרת, להפסיק את תהליך ייבוש ההקפאה כאשר הטמפרטורה של המיקליה נשארת קבועה. הסר את הסלק ומיד לאטום אותם עם כובעי בורג שסופקו.
ראשית להוסיף 1.5 גרם של mycelia וכדור שחיקה לתוך צנצנת שחיקה של טחנת כדור. טוחנים את האבקה ה mycelial ב 25 הרץ במשך 30 שניות ולהעביר את אבקת mycelial לצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר. להטות את הצינור כדי לאפשר ערבוב הבא של mycelia עם החיץ, ולאחר מכן להוסיף שישה מיליליטר של חיץ מיצוי קר כקרח B250, כולל קוקטייל מעכב פרוטאז 1X, לכל גרם של אבקת mycelial ולהשתלב עם מרית קטנה עד הומוגניזציה מלאה של תמצית גולמי מושגת; לשמור את הצינור על הקרח במשך חמש דקות.
לאחר מכן מניחים את הצינור ואת צינור איזון לתוך צנטריפוגה ולסובב ב 40, 000 פעמים g ו ב 4 מעלות צלזיוס לפחות 20 דקות. במהלך הצנטריפוגה, הגדר עמוד כרומטוגרפיה חד פעמי 10 מיליליטר כדי להתחיל לצייד את שף IgG. פיפטה 300 מיקרוליטרים של שף IgG שנוסף היטב לתוך הטור.
מלא את העמודה ל- 10 מיליליטר עם B250 ותן למאגר לזרום דרך כוח הכבידה. הוסף מיליליטר אחד של B250 כולל קוקטייל מעכב פרוטאז 1X ולתת לו לזרום דרך, ולאחר מכן לחבר את החלק התחתון של העמודה. לאחר הצנטריפוגה, הסר 10 מיקרוליטרים של העל-טבעי לניתוח SDS-PAGE.
מניחים את המדגם לתוך צינור 1.5 מיליליטר המכיל 40 microliters של מים ו 12.5 microliters של LSB 5X. באמצעות פיפטה סרולוגית, הסר בזהירות את העל-טבעי והעבר אותו לעמודה המכילה את גם חבילות IgG. סגור את העמודה על-ידי אבטחה הדוקה של מכסת הקצה שסופקה.
כדי להתחיל, דגירה טור כרומטוגרפיה על מערבל סיבובי ב 10 סל"ד וב ארבע מעלות צלזיוס במשך שעתיים עד ארבע שעות. לאחר מכן, הסר את המכסה ופתח את העמודה בתחתית כדי לאסוף את הזרימה. כדי לשטוף את העמוד, השתמש pipetter להוסיף מיליליטר אחד של חיץ כביסה 250 למכסה העמודה כדי להסיר את כל חרוזים לכודים ולהעביר את ההשעיה בסמוק אחד על שף מיושב כדי resuspend את חרוזים.
לאחר מכן מלאו את העמודה למעלה במאגר כביסה 250 וסגרו אותה באמצעות מכסה מחסנית המחובר למשאבה פריסטואלית. התחל את המשאבה peristaltic ולהתאים את המשאבה לקצב זרימה של כ 1 עד 5 מיליליטר לדקה, לחזור על תהליך כביסה זה עבור סך של ארבע שטיפות, ולאחר מכן לחזור על תהליך כביסה זה שלוש פעמים באמצעות מאגר שיווי משקל TEV. סגור את עמודת הכרומטוגרפיה בתחתית.
תוסיפו את גם את גם 10 מיליליטר של חיץ המחשוף TEV ותוסיפו 20 מיקרוליטרים של קוקטייל מעכב פרוטאז פי 50 ו-10 מיקרוליטרים של TEV. המכסה הבא את העמוד ואת הדגירה על מערבל סיבובי ב 10 סל"ד וב ארבע מעלות צלזיוס לילה כדי לחמק מתחמי החלבון קשור באמצעות HDAC מתויג. למחרת, לפתוח את העמוד ולאסוף את eluate בצינור צנטריפוגה שני מיליליטר.
השתמש 0.7 מיליליטר של מאגר מחשוף TEV כדי להסיר את חרוזים מן הכובע כדי לשטוף את הקיר של העמוד. מניחים את צינור הצנטריפוגה שני מיליליטר לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר ולאחר מכן למקם את העמוד על הצינור פתוח שני מיליליטר. העבר את כל ההרכבה הזאת על צנטריפוגה שולחן ולסובב ב 300 פעמים g במשך שתי דקות כדי לקבל את TEV eluate.
במחקר זה, העשרה צעד אחד של HDAC מסוג TAP מתויג 1 מן הפטרייה filamentous Aspergillus nidulans מבוצעת להערכת פעילות in vitro deactylase. תוצאה אופיינית של זה ממחישה בבירור את היעילות של צעד הזיקה הראשון, אשר גדל עוד יותר בעת ביצוע טיהור טנדם. רוב החלבונים הבולטים הקיימים בתמצית החלבון והזרימה דרך, עם זאת, כבר מרוקנים ב- TEV eluate.
אימונובלו מראה אותות חזקים נודדים בערך 120 קילודלטונים המתאימים ל- CBP מתויג באורך מלא RpdA ב- TEV eluate, זרימת הרגידולין דרך, ולהרים שברים. בדיקת פעילות deactylase נציג עם מעכב HDAC ספציפי Trichostatin A מוצג כאן. רגישות הפעילות מאשרת כי הערכים הנמדדים נובעים מ- RpdA ולא נגרמים על ידי פעילות פרוטאז לא ספציפית.
זה חשוב כפי שהוא מציין כי פרוטאז TEV, אשר קיים בריכוז גבוה למדי, אינו מפריע להסטת פעילות HDAC. מעניין, פעילות HDAC מצטמצמת באופן משמעותי לאחר שלב טיהור הזיקה השני, CE, בהשוואה ל- TEV eluate. על מנת לאפשר מיצוי חלבון יעיל, ודא כי mycelia הם הקרקע אבקה עדין.
זה קריטי במיוחד כאשר אין מכונה זמינה מרגמה ועלי משמשים שחיקה. התוספת של שלב הזיקה השני לפרוטוקול גורמת לשברים טהורים מספיק לזיהוי חלבונים אך נעשים על ספקטרומטריית מסה. בעת עבודה עם חנקן נוזלי, הקפד ללבוש משקפי בטיחות וכפפות מגן, כדי למנוע פגיעה גופנית.
