The work is supported by HHMI. We thank our lab members for their help with testing the protocol and revising the manuscript.

1. בנייה של ה- LED הפנס הערה: ציוד LED הנדרש מסוכם הרשימה של חומרים. ההתקנה LED כולו הוא קטן והוא יכול להיות ממוקם בכל מקום במעבדה, אם כי מומלץ להשתמש בו יוצב בחדר חשוך לשלוט חשיפה לאור של תולעים 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את LED לבקר עם כבלים (איור 1 א, ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את בקר מגבר גנרטור / פונקציה דיגיטלי באמצעות כבל BNC (איור 1 א &#39;, ג&#39;, ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן 10 ס&quot;מ הנורית מעל לבמה בעזרת בעל מותאם אישית (איור 1 א). הערה: עשינו בעל עם חלקי מתכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את התקנת תאורת LED חלקית, אבל למנוע הצטברות חומה (איור 1 ב &#39;), מה שהופך תולעים חולים. הערה: אנו משתמשים כיסוי פלסטיק קשיח מחוייט עם העליון פתוח והתחתון (איור 1 א). הכיסוי אינו נדרש עבור mutagenesis עצמו, אך משמש to להגביל את החשיפה המיותרת של האור הכחול אל הסביבה. אנו ממליצים לא לכסות את התקנת LED לחלוטין (איור 1B) כדי למנוע התחממות יתר של התולעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש להרכיב משקפיים בלייזר-מגן. הערה: אנו להרכיב משקפיים בלייזר-מגן מפני שהאור הוא בהיר מאוד. משקפי שמש יפעלו גם כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את הידית של הבקר LED ל &#39;Int.&#39; עבור תאורה רציפה (1D איור) ולהגדיר אותו ב 65% של הכוח המרבי (תרשים 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פוטומטר כדי למדוד את עוצמת האור הכחולה על הבמה שבו התולעים ממוקמים באמצעות הפרוטוקול של היצרן. ההתקנה נותנת 2.0 mW / 2 מ&quot;מ תחת תאורה רציפה. </li></ol> 2. טיפול תכלת הערה: השתמש זן CZ20310 juSi164 [Pmex-5-HIS-72 :: miniSOG-3&#39;UTR (TBB-2) + CB-UNC-119 (+)] UNC-119 (ed3) III 4 זן זמין. במרכז גנטיקה Caenorhabditis (CGC, http: //www.cgc.cbs.umn.edu/). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמירה על זן-mSOG שלו בחושך על מדיום הגידול נמטודות סטנדרטי (NGM) צלחות עם E. coli OP50 בא פרוטוקול סטנדרטי 10,11. הערה: תחת אור הסביבה, זנים המכילים juSi164 אינם מציגים שיעור מוטציות מעל שיעור ספונטני 4. מעבר למתח שיגרתי באמצעות היקף ניתוחים עם מנורת הלוגן בדרך כלל אינו גורם מוטציות גם כן. עם זאת, יש להיזהר כדי למנוע חשיפה מיותרת לאור, למשל, שמירה על זני חממה כהה בתוך סטנדרטית, או כיסוי הזנים עם רדיד. מומלץ להקפיא aliquots של המתח לאחר שקיבל אותה במקרה מיותר מוטציות לצבור לאורך זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק הרה להולדת מבוגרים צעירים (כ 12 שעות לאחר-L4) חיות עם תולעת לאסוף 11. הערה: בעלי חיים צעירים להראות פחות מוטגנים אפקט 4, בעוד בעלי חיים מבוגרים יכולים להיות גודל גוזלים נמוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים p מסנןaper כדי להתאים צלחת 60 מ&quot;מ עם 25 מ&quot;מ x 25 מ&quot;מ חור מרובע ומניחים על צלחת unseeded (איור 1E). הערה: אגרוף מרובע ניתן להשתמש אך בגודל של אגרוף לא חייב להיות מדויק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרוק 100 μL של 100 מ&quot;מ CuCl 2 על נייר הסינון שווה להגביל תולעים בתוך החור המרובע על הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק מספר רצוי של הרמפרודיטים מבוגרים צעירים הרה להולדת (ראה שלב 3 עבור דוגמא) ולהעביר למרכז הצלחת 2 CuCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש להרכיב משקפיים בלייזר מגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדליק את הנורית ואת מחולל פונקציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את הידית של בקר LED ל &#39;שלוחה.&#39; כדי לשלוט בו על ידי מחולל אותות (1D איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את בקר ב 65% של הכוח המרבי ואת מחולל פונקציה כמו גל סינוס, 4 הרץ (תרשים 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת 2 CuCl משלב 2.5 ללא מכסה על הבמה תחת LED (איור 1 א &lt;/ Strong&gt;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאיר את החיות עם אור כחול עבור 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר מחפשים תולעים בריאים לצלחת זורעי ע 0. הערה: המספר הרצוי של P 0 תלוי בסוג של המסך. ראה שלב 3 עבור דוגמה. תולעי P 0 עשויים להיראות חסר קואורדינציה מייד לאחר טיפול אור יתאוששו לאורך זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור תולעים המכוסים באמצעות רדיד באינקובטור או בחושך; ופעל לפי הנוהל המקובל להתחיל הקרנה פנוטיפים רצוי בקרב הצאצאים שלהם 2,10. </li></ol> דוגמא 3. של מסך גנטי קדימה הערה:. זוהי דוגמא של המסך המשובט עם 120 גנומים הפלואידים לבדוק אם LED והמתח עובדים איור 2 מראה סכמטי של ההליך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> [Day1] לאחר טיפול באור כחול, לאסוף חמישה תולעים ובריאים לצלחת NGM עם OP50 כמו P 0, לשמור אותם בתוך חממת 20 ° C, ולתת להם להטיל ביצים עבור 1ד (צלחת &#39;Day1&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> [יום 2] העברת P 0 לצלחת חדשה זורעת (הצלחת &#39;יום 2&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> [Day3] פיק ולהרוג P 0 על הצלחת &#39;יום 2&#39; על ידי שריפת אותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> [Day4] פיק 30 בוגרים צעירים הרה להולדת F 1 מהצלחת &#39;Day1&#39; ולהעבירם לצלחות בודדים (30 צלחות F 1 עבור &#39;Day1&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> [Day5] חזור על שלב 3.4 עבור הצלחת &#39;יום 2&#39; (30 F 1 צלחות עבור &#39;יום 2&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> [Day7-9] בדוק את מורפולוגיות ו / או התנהגות חריגה של F 2 תולעים בהשוואה לזן WT (איור 3 א) תחת סטראו רגיל כאשר הם הופכים למבוגרים. הערה: מציג מוטציה תורשתית כרבע תולעים עם אותו הפנוטיפ בין F 2 כאשר הוא רצסיבי עם חדירות גבוהות. עם זאת, כמה מוטציות עשויות לגדול לאט ו / או להציג חדירות חלקיות. לכן, יתכן כי פחות מרבע של מוטציות ניתן למצוא עלצַלַחַת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק תולעים עם פנוטיפים גלויים בנפרד ולבדוק התורשתיות של הפנוטיפ בדור הבא. </li></ol> דוגמה 4. של אינטגרציה extrachromosomal transgene <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את ה- DNA של עניין לתוך CZ20310 juSi164 [Pmex-5-HIS-72 :: miniSOG-3&#39;UTR (TBB-2) + CB-UNC-119 (+)] UNC-119 (ed3) ולהכין תולעים מהונדס עם שיעור התמסורת נמוך (10-30%) בעקבות 12,13 פרוטוקול זריקה רגילה. הערה: לחלופין, מערכי extrachromosomal הוקמו ניתן חצו לתוך זני juSi164. כדי למנוע גנוטיפ עבור juSi164, heterozygotes juSi164 עשוי לשמש P 0 אם כי היעילות להצטמצם. שיטת גנוטיפ עבור juSi164 מתואר בסעיף 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> [Day1] פנקו ~ 20 חיות טרנסגניות ע 0 עם אור כחול כמתואר שלב 2. הערה: תולעי P 0 פרטים נוספים נחוצים תלוי tr<html> שיעור ansmission. Transgenes ניתן לזהות על ידי פנוטיפים או coinjection סמן 12,13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק 10 מחפש P 0 בריא לצלחות פרט, לשמור אותם בתוך חממת C 20 °, ולתת להם להטיל ביצים במשך כמה ימים (P 0 צלחות) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> [Day4] יחיד מתוך 20 מהונדס F 1 תולעים מכל צלחת P 0 לצלחות הפרט ולתת להם להטיל ביצים. (20 F 1 x 10 P 0 צלחות = 200 F 1 צלחות בסך הכל.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> [יום 7 ג] מצא F 1 צלחות עם&gt; 75% F 2 transgenes שיש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק חמש חיות טרנסגניות משיעור העברת 75%&gt; F 1 צלחות (F 2 צלחות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> [Day10] שמור F 2 צלחות עם שיעור תמסורת 100% כקווים משולבים פוטנציאליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Outcross הקווים פוטנציאל המשולבים באמצעות הליך סטנדרטי 10 לבדוק את פרדת מנדל וכדי להסיר מוטציות רקע פוטנציאליות. </li></ol>le &quot;&gt; 5. Genotyping <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse 20 outcrossed F 2 תולעים חיץ תמוגה באמצעות פרוטוקול סטנדרטי 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע PCR באמצעות פריימרים עבור MosSCI הכנסת 9, juSi164, (טבלה 1) עם טמפרטורה חישול של C ° 58 בעקבות פרוטוקול סטנדרטי 14. הערה: אין צורך גנוטיפ UNC-119 (ed3) כי UNC-119 (ed3) יכולים להיות מזוהים על ידי התנהגות לא מתואמת לאחר הסרת transgene ההצלה (juSi164) בשלבים הבאים 5.4 ו -5.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose 15 ולבחון את הגדלים הלהקה (טבלה 1) כדי למצוא את WT עבור juSi164. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק אם צאצאי F 2 שתקו תולעים בשל קיומו של UNC-119 (ed3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תולעים מתואמים נמצאים על צעד 5.4, אחת כמה תולעים nonuncoordinated להשיג את כל התולעים nonuncoordinated בדור הבא. </li></ol>

<ol>
	<li>Jorgensen, E. M., Mango, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+and+design+of+genetic+screens:+caenorhabditis+elegans.">The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans.</a> Nat Rev Genet. 3 (5), 356-369 (2002).</li><li>Kutscher, L. M., Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+and+reverse+mutagenesis+in+C.+elegans.">Forward and reverse mutagenesis in C. elegans.</a> WormBook. , 1-26 (2014).</li><li>Collins, J., Saari, B., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+a+transposable+element+in+the+germ+line+but+not+the+soma+of+Caenorhabditis+elegans.">Activation of a transposable element in the germ line but not the soma of Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 328 (6132), 726-728 (1987).</li><li>Noma, K., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+mutagenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">Optogenetic mutagenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Commun. 6, 8868 (2015).</li><li>Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+DNA+damage:+mechanisms,+mutation,+and+disease.">Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease.</a> FASEB J. 17 (10), 1195-1214 (2003).</li><li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+tag+for+correlated+light+and+electron+microscopy+of+intact+cells,+tissues,+and+organisms.">A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms.</a> PLoS Biol. 9 (4), 1001041 (2011).</li><li>Ruiz-Gonzalez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Singlet+oxygen+generation+by+the+genetically+encoded+tag+miniSOG.">Singlet oxygen generation by the genetically encoded tag miniSOG.</a> J Am Chem Soc. 135 (26), 9564-9567 (2013).</li><li>Pimenta, F. M., Jensen, R. L., Breitenbach, T., Etzerodt, M., Ogilby, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-dependent+photochemistry+and+photophysics+of+"miniSOG,"+a+protein-encased+flavin.">Oxygen-dependent photochemistry and photophysics of "miniSOG," a protein-encased flavin.</a> Photochem Photobiol. 89 (5), 1116-1126 (2013).</li><li>Frokjaer-Jensen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+and+targeted+transgene+insertion+in+Caenorhabditis+elegans+using+a+modified+Mos1+transposon.">Random and targeted transgene insertion in Caenorhabditis elegans using a modified Mos1 transposon.</a> Nat Methods. 11 (5), 529-534 (2014).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+worm+lab:+from+culturing+worms+to+mutagenesis.">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> J Vis Exp. (47), (2011).</li><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection.">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. (18), (2008).</li><li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transformation.">DNA transformation.</a> Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).</li><li>Fay, D., Bender, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mapping+and+manipulation:+chapter+4--SNPs:+introduction+and+two-point+mapping.">Genetic mapping and manipulation: chapter 4--SNPs: introduction and two-point mapping.</a> WormBook. , 1-7 (2006).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li><li>Westberg, M., Holmegaard, L., Pimenta, F. M., Etzerodt, M., Ogilby, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+an+efficient,+genetically+encodable,+protein-encased+singlet+oxygen+photosensitizer.">Rational design of an efficient, genetically encodable, protein-encased singlet oxygen photosensitizer.</a> J Am Chem Soc. 137 (4), 1632-1642 (2015).</li><li>Xu, S., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+optogenetic+cell+ablation+in+C.+elegans+using+membrane-targeted+miniSOG.">Highly efficient optogenetic cell ablation in C. elegans using membrane-targeted miniSOG.</a> Sci Rep. 6, 21271 (2016).</li><li>Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+protocol+for+integrating+extrachromosomal+arrays+with+high+transmission+rate+into+the+C.+elegans+genome.">A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome.</a> J Vis Exp. (82), (2013).</li><li>Lin, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+inhibition+of+synaptic+release+with+chromophore-assisted+light+inactivation+(CALI).">Optogenetic inhibition of synaptic release with chromophore-assisted light inactivation (CALI).</a> Neuron. 79 (2), 241-253 (2013).</li><li>Minevich, G., Park, D. S., Blankenberg, D., Poole, R. J., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CloudMap:+A+Cloud-Based+Pipeline+for+Analysis+of+Mutant+Genome+Sequences.">CloudMap: A Cloud-Based Pipeline for Analysis of Mutant Genome Sequences.</a> Genetics. 192 (>4), 1249-1269 (2012).</li><li>Qi, Y., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiniSOG-mediated+Photoablation+in+Caenorhabdtis+elegans.">MiniSOG-mediated Photoablation in Caenorhabdtis elegans.</a> Bio-protocol. 3 (1), 316 (2013).</li><li>Qi, Y. B., Garren, E. J., Shu, X., Tsien, R. Y., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-inducible+cell+ablation+in+Caenorhabditis+elegans+using+the+genetically+encoded+singlet+oxygen+generating+protein+miniSOG.">Photo-inducible cell ablation in Caenorhabditis elegans using the genetically encoded singlet oxygen generating protein miniSOG.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (19), 7499-7504 (2012).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+activation+of+channelrhodopsin-2+in+excitable+cells+of+Caenorhabditis+elegans+triggers+rapid+behavioral+responses.">Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses.</a> Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

כאן אנו מתארים הליך מפורט של mutagenesis optogenetic באמצעות שלו-mSOG לידי ביטוי germline ולספק דוגמה של מסך גנטי קדימה בקנה מידה קטן. לעומת mutagenesis כימי סטנדרטי, שיטת mutagenesis optogenetic זה יש מספר יתרונות. ראשית, זה לא רעיל, ובכך שמירה על אנשי המעבדה הרחק מוטאגנים כימיים רעילים כגון EMS, ENU ו trime...

מסך גנטי קדימה כבר בשימוש נרחב כדי ליצור מוטציות גנטיות לשבש תהליכים ביולוגיים שונים באורגניזמים מודל כגון elegans Caenorhabditis (ג elegans) 1. ניתוח של מוטציות כאלה להוביל לגילוי של גנים חשובים מבחינה תפקודית והאיתות שלהם מסלולי 1,2. באופן מסורתי, mutagenesis ב C. elegans מושגת באמצעות כימיקלים מוטגנים, קרינה, או transposons 2. כימיקלים כגון methanesulfonate אתיל (EMS) ו- N -ethyl- -nitrosourea N (ENU) הם רעילים לבני אדם; קרני גאמא או אולטרה סגול (UV) mutagenesis קרינה דורש ציוד מיוחד; זני transposon-פעיל, כגון זנים המוטטורי 3, יכולים לגרום מוטציות מיותרות במהלך תחזוקה. פיתחנו גישה פשוטה לגרום מוטציות תורשתיות באמצעות פוטוסנסיטייזר גנטית בקידוד 4. (Reactive oxygen species ROS) יכול לגרום נזק לדנ&quot;א 5.מחולל חמצן גופיה מיני (miniSOG) הוא חלבון פלואורסצנטי ירוק של 106 חומצות אמינו כי תוכננה מן LOV (אור, חמצן, ואת מתח) תחום של ארבידופסיס phototropin 2 6. בחשיפה לאור כחול (~ 450 ננומטר), miniSOG מייצר חמצן גופיית ROS כולל עם fl יבין mononucleotide בתור פקטור 6-8, אשר שוהה בכל התאים. בנינו חלבון היתוך-mSOG שלו על ידי תיוג miniSOG אל C- הסופי של היסטון-72, ג elegans וריאנט של היסטון 3. אנחנו שנוצר transgene חד עותק 9 להביע-mSOG שלו ב germline של ג elegans. בתנאי תרבות נורמלים בחושך, התולעים המהונדסים-mSOG שלו יש גודל גוזלים נורמלי תוחלת חי 4. בחשיפה לאור LED כחול, התולעים שלו-mSOG לייצר מוטציות תורשתיות בקרב הצאצאים שלהם 4. הספקטרום של מוטציות מושרות כולל שינויי נוקלאוטיד, כגון G: C ל- T: A ו- G: C ל- C: G ו- chromoso הקטןלי מחיקות 4. הליך mutagenesis זה הוא פשוט לביצוע, ודורש התקנת בטיחות במעבדה מינימאלית. כאן, אנו מתארים את התקנת תאורת LED ונהלי mutagenesis optogenetic.

<table><tbody><tr><td>Ultra High Power LED light source</td><td>Prizmatix</td><td>UHP-mic-LED-460</td><td>460 &amp;plusmn; 5 nm</td></tr><tr><td>LED controller</td><td>Prizmatix</td><td>UHPLCC-01</td><td></td></tr><tr><td>Digital function generator/amplifier</td><td>PASCO</td><td>PI-9587C</td><td>PI-9587C is no longer available. The replacement is PI-8127.</td></tr><tr><td>BNC cable male/male</td><td>THORLABS</td><td>CA3136</td><td></td></tr><tr><td>USB-TTL interface</td><td>Prizmatix</td><td></td><td>Optional</td></tr><tr><td>Photometer</td><td>THORLABS</td><td>PM50 and Model D10MM</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper</td><td>Whatman</td><td>1001-110</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>MZ95</td><td></td></tr><tr><td>NGM plate</td><td></td><td></td><td>Dissolve 5 g NaCl, 2.5 g Peptone, 20 g Agar, 10 &amp;micro;g/mL cholesterol in 1 L H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. After autoclaving, add 1 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 1 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 25 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;(pH 6.0).&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Lysis solution</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris(pH 8.8), 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100, 2.5 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 100 &amp;micro;g/mL Proteinase K</td></tr></tbody></table>

optogenetic random mutagenesis using histone-minisog in c. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

ביצענו מסך גנטי קדימה עם CZ20310 juSi164 UNC-119 (ed3) באמצעות חשיפה לאור 30 דקות בעקבות פרוטוקול סטנדרטי האמור בסעיפים 2 ו -3 בין 60 צלחות F 1 המתאים 120 גנומים הפלואידים mutagenized, מצאנו 8 F 1 צלחות עם F 2 תולעים מוצגות פנוטיפים גלויים כגון פגם לגודל ג...

Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans at JoVE.com

Mutagenese אקראי אופטוגנטי באמצעות Histone-miniSOG ב-C. elegans | גנטיקה | וִידֵאוֹ

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

גנטי בקידוד היסטון-miniSOG גורם מוטציות תורשתי הגנום כולו באופן אור תלוי כחול. שיטת mutagenesis זה היא פשוטה, מהירה, ללא כימיקלים רעילים, מתאים היטב סריקה גנטית קדימה ואינטגרציה transgene.

Optogenetic mutagenesis אקראי באמצעות היסטון-miniSOG ב<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

optogenetic-random-mutagenesis-using-histone-minisog-in-c-elegans

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Genetics

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Classical and Modern Genetics

SCIENTISTS IN ACTION

9.0K Views.  University of California in San Diego and Howard Hughes Medical Institute.  גנטי בקידוד היסטון-miniSOG גורם מוטציות תורשתי הגנום כולו באופן אור תלוי כחול. שיטת mutagenesis זה היא פשוטה, מהירה, ללא כימיקלים רעילים, מתאים היטב סריקה גנטית קדימה ואינטגרציה transgene. 

Video: Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

ממוקד<em&gt; באתרו</em&gt; גני mutagenesis של היסטון שמרים הנץ

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve random mutagenesis, error-prone PCR is a convenient and efficient strategy for generating a diverse pool of mutants (i.e., a mutant library). Error-prone PCR is the method of choice when a researcher seeks to mutate a pre-defined region, such as the coding region of a gene while leaving other genomic regions unaffected. After the mutant library is amplified by error-prone PCR, it must be cloned into a suitable plasmid. The size of the library generated by error-prone PCR is constrained by the efficiency of the cloning step. However, in the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, the cloning step can be replaced by the use of a highly efficient one-step fusion PCR to generate constructs for transformation. Mutants of desired phenotypes may then be selected using appropriate reporters. Here, we describe this strategy in detail, taking as an example, a reporter inserted at centromeric heterochromatin.

This article describes a detailed methodology for random mutagenesis of a target gene in fission yeast. As an example, we target rpt4+, which encodes a subunit of the 19S proteasome, and screen for mutations that destabilize heterochromatin.

גן במיקוד אקראי מוטגנזה מכוונת לבחירת יציב הטרוכרומטין פרוטאוזום מוטציות שמרים ביקוע

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been co-opted as a powerful tool for precise eukaryotic genome engineering. Here, we present a rapid and simple method using chimeric single guide RNAs (sgRNA) and CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) for the efficient and precise generation of genomic point mutations in C. elegans. We describe a pipeline for sgRNA target selection, homology-directed repair (HDR) template design, CRISPR-Cas9-RNP complexing and delivery, and a genotyping strategy that enables the robust and rapid identification of correctly edited animals. Our approach not only permits the facile generation and identification of desired genomic point mutant animals, but also facilitates the detection of other complex indel alleles in approximately 4 - 5 days with high efficiency and a reduced screening workload.

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Here, we present a method to engineer the genome of C. elegans using CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins and homology dependent repair templates.

מהירה עם צינור נתיישב עבור יצירת מוטציות נקודה גנומית ב- C. elegans באמצעות CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

היישום של RNAi חום-הלם-induced בביטוי פקטור שעתוק כדי לתכנת בתאי הנבט את הנוירונים C . elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Developmental Biology

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Neuroscience

An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane sulfonate (EMS) and 4, 5', 8-trimethylpsoralen combined with ultraviolet light (TMP/UV). Nematodes are powerful biological systems for genetics studies because of their simple body plan and mating system, which is composed of self-fertilizing hermaphrodites and males that can generate hundreds of progeny per animal. Nematodes are maintained in agar plates containing a lawn of bacteria and can be easily transferred from one plate to another using a pick. EMS is an alkylating agent commonly used to induce point mutations and small deletions, while TMP/UV mainly induces deletions. Depending on the species of nematode being used, concentrations of EMS and TMP will have to be optimized. To isolate recessive mutations of the nematode Pristionchus pacificus, animals of the F2 generation were visually screened for phenotypes. To illustrate these methods, we mutagenized worms and looked for Uncoordinated (Unc), Dumpy (Dpy) and Transformer (Tra) mutants.

Screening for mutants with phenotypic defects is a straightforward method for identifying genes that function in a given biological process. In this article we describe how to culture free living worms (e.g., Pristionchus pacificus) in the laboratory and show two different mutagenesis methods, EMS and TMP/UV.

מבוא מעבדה תולעת: מ תולעים culturing כדי mutagenesis

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

הדמיה ג elegans עוברים באמצעות מיקרוסקופ Epifluorescent ותוכנות קוד פתוח

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that exhibit partial and variable transmission rates of extrachromosomal arrays to the next generation. In addition, transgenic animals are mosaic and express the transgene in a variable number of cells. Extrachromosomal arrays can be integrated into the C. elegans genome using UV irradiation to establish nonmosaic transgenic strains with 100% transmission rate of the transgene. To that extent, F1 progenies of UV irradiated transgenic animals are screened for animals carrying a heterozygous integration of the transgene, which leads to a 75% Mendelian transmission rate to the F2 progeny. One of the challenges of this method is to distinguish between the percentage of transgene transmission in a population before (X% transgenic animals) and after integration (&#8805;75% transgenic F2 animals). Thus, this method requires choosing a nonintegrated transgenic line with a percentage of transgenic animals that is significantly lower than the Mendelian segregation of 75%. Consequently, nonintegrated transgenic lines with an extrachromosomal array transmission rate to the next generation &#8804;60% are usually preferred for integration, and transgene integration in highly transmitting strains is difficult. Here we show that the efficiency of extrachromosomal arrays integration into the genome is increased when using highly transmitting transgenic lines (&#8805;80%). The described protocol allows for easy selection of several independent lines with homozygous transgene integration into the genome after UV irradiation of transgenic worms exhibiting a high rate of extrachromosomal array transmission. Furthermore, this method is quite fast and low material consuming. The possibility of rapidly generating different lines that express a particular integrated transgene is of great interest for studies focusing on gene expression pattern and regulation, protein localization, and overexpression, as well as for the development of subcellular markers.

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

This protocol describes a rapid and low material consuming procedure for the integration of transgenic extrachromosomal arrays into the Caenorhabditis elegans genome using ultra violet (UV) irradiation. Furthermore, this protocol is particularly well suited for transgenic lines that transmit extrachromosomal arrays at a high rate.

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

שיטות מחקר לשינויים הגלום צבירת חלבון עם הגיל ב Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

RNAi Feeding in Liquid Culture: A High-Throughput Method to Knockdown Gene Expression in C. elegans

Source: Groh, N. et al. <a href="https://www.jove.com/video/56464/methods-to-study-changes-inherent-protein-aggregation-with-age">Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in&#160;Caenorhabditis elegans</a>.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2017).
RNAi is powerful genetic tool available to C. elegans researchers. This video introduces a method to treat more worms with RNAi than plate feeding by utilizing liquid culture conditions.

הזנת RNAi בתרבית נוזלית: שיטה בעלת תפוקה גבוהה להשמטת ביטוי גנים ב- C. elegans

Source: Groh, N. et al. Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in&#160;Caenorhabditis elegans.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2017).
...

Optogenetic mutagenesis אקראי באמצעות היסטון-miniSOG ב

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ממוקד

גן במיקוד אקראי מוטגנזה מכוונת לבחירת יציב הטרוכרומטין פרוטאוזום מוטציות שמרים ביקוע

מהירה עם צינור נתיישב עבור יצירת מוטציות נקודה גנומית ב- C. elegans באמצעות CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

היישום של RNAi חום-הלם-induced בביטוי פקטור שעתוק כדי לתכנת בתאי הנבט את הנוירונים C . elegans

בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans

מבוא מעבדה תולעת: מ תולעים culturing כדי mutagenesis

הדמיה ג elegans עוברים באמצעות מיקרוסקופ Epifluorescent ותוכנות קוד פתוח

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

שיטות מחקר לשינויים הגלום צבירת חלבון עם הגיל ב Caenorhabditis elegans

הזנת RNAi בתרבית נוזלית: שיטה בעלת תפוקה גבוהה להשמטת ביטוי גנים ב- C. elegans