זהו הפרוטוקול הראשון המאפשר להתמיין תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם לתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח בעלי תכונות מחסום טובות, צמתים הדוקים בוגרים וביטוי של מולקולות היצמדות תאי אנדותל המתווכות נדידת תאים חיסוניים למערכת הטירון המרכזית. תאים דמויי EECM-BMEC מאפשרים לחקור נדידת תאי חיסון דרך מחסום הדם במוח באמצעות מודלים של מחסום דם מוחי הנגזרים מהמטופלים באופן אוטולוגי מלא. התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם מחולי טרשת נפוצה לתאים דמויי EECM-BMEC אפשרה לנו לזהות פגמים במחסום פנימי במודלים במבחנה אלה של חולי טרשת נפוצה.
שיטה תרבותית זו תאפשר לנו אפוא לזהות בעתיד את המסלולים המולקולריים העומדים בבסיס תכונות מחסום לקויות אלה. שיטות אלה יכולות להיות מיושמות על ספקטרום רחב יותר של מחלות שבהן מורפולוגיה בסרום וחדירת תאים חיסוניים לתוך CNS הם קריטיים עבור פתוגנזה אלה, למשל, שבץ או neuroinfection. כאשר מנסים טכניקה זו בפעם הראשונה, להשתמש באותה כמות של חומרים התא.
צפיפות הזריעה היא המפתח להצלחה של פרוטוקול זה ויש להתאים אותה בהתאם לשיבוטים המשמשים. מי שידגים את ההליך יהיה קיניה מאטסו, עוזר פרופסור מהמעבדה שלי. ביום החמישי של תרבית תאי האב של האנדותל, שואפים את התווך מהבארות ומוסיפים מיליליטר אחד של מגיב דיסוציאציה לכל באר.
דוגרים על הצלחת במשך שש עד שמונה דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. באמצעות micropipette לנתק ו singularize את התאים. לאחר מכן, העבירו את תרחיף התא דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר כדי לסנן לתוך צינור 50 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של DMEM/F-12 10 בינוני.
כדי לעצור את תגובת העיכול, הוסף DM DMEM/F-12 10 בינוני עד לסימן 50 מיליליטר. ביסודיות פיפטה ולשמור 10 מיקרוליטר לספירת התאים. צנטריפוגה את צינור 50 מיליליטר ב 200 גרם במשך חמש דקות ב 20 עד 25 מעלות צלזיוס כדי לגלול את התאים.
לאחר הצנטריפוגה, להסיר את supernatant ולהשהות מחדש את גלולת התא עם 10 מיליליטר של DMEM/F-12 10 בינוני. מעבירים את תרחיף התא לצינור 15 מיליליטר טרי. צנטריפוגה ב 200 גרם במשך חמש דקות ב 20 עד 25 מעלות צלזיוס כדי להניע את התאים שוב.
לאחר מכן השהה מחדש את גלולת התא לתוך מאגר זרימה אחד. לאחר מכן, הוסף את מגיב חסימת FCR ביחס של אחד עד 100 ודגר במשך חמש דקות. לאחר מכן הוסף את אחד ל 200 יחס מדולל fluorescein isothiocyanate או FITC שכותרתו נוגדן CD31.
לדגור על המתלה במשך 30 דקות בחושך בטמפרטורה בין 20 ל 25 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, הוסף 10 מיליליטר של חיץ זרימה אחד לדגימה ושמור 10 מיקרוליטר של התרחיף לניתוח ציטומטריית זרימה כדי לקבוע את החלק של תאים חיוביים CD31. צנטריפוגה את התאים ב 200 גרם במשך חמש דקות ב 20 עד 25 מעלות צלזיוס.
לאחר צנטריפוגה להשהות מחדש את התאים עם חיץ זרימה פתרון אחד. לאחר מכן, להוסיף חמישה מיקרוליטר של קוקטייל הבחירה FITC לכל 100 מיקרוליטר של השעיית התא. מערבבים היטב את התמיסה על ידי פיפטינג ודגרים בחושך במשך 15 דקות בטמפרטורה שבין 20 ל -25 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, הוסף חמישה מיקרוליטרים של ננו-חלקיקים מגנטיים לכל 100 מיקרוליטר של השעיית תאים. פיפטה את התערובת היטב לדגור בחושך במשך 10 דקות ב 20 עד 25 מעלות צלזיוס. העבר את תרחיף התא לצינור ציטומטריית זרימה של חמישה מיליליטר והוסף חיץ זרימה אחד לקבלת נפח כולל של 2.5 מיליליטר.
לאחר מכן הניחו את צינור ציטומטריית הזרימה במגנט למשך חמש דקות. בתנועה רציפה, הפוך את המגנט ונטרל את תרחיף התא המכיל תאים ללא תווית של נוגדן FITC CD31. שמור על המגנט והצינור במצב הפוך למשך שתיים עד שלוש שניות ולאחר מכן הסר את הנוזל שנותר.
שאפו טיפות על קצה הצינור לפני שתחזירו את הצינור למצב זקוף. אחזר את ציטומטריית הזרימה מהמגנט והוסף 2.5 מיליליטר של חיץ זרימה אחד כדי לשטוף את התאים החיוביים הנותרים CD31. בעדינות פיפטה את התאים למעלה ולמטה פעמיים או שלוש כדי להשעות אותם מחדש.
לאחר מכן הכניסו את צינור הזרימה למגנט למשך חמש דקות. חזור על הכביסה לפחות ארבע פעמים כדי להסיר את התאים הלא מסומנים של FITC CD31 מהשפופרת. הסר את צינור הזרימה מהמגנט והשהה מחדש את התאים החיוביים CD31 מטוהרים עם הכמות הרצויה של מדיום מתאים.
שמור שני aliquots 10 מיקרוליטר של התרחיף, אחד לספירת תאים והשני לבצע ניתוח ציטומטריה זרימה כדי להעריך את הטוהר של תאים חיוביים CD31 בדגימות מיון תאים מופעלים פוסט-מגנטיים. הסר את תווך HECSR משש לוחיות באר המכילות אוכלוסיות תאי אנדותל ותאים שאינם אנדותל. לאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד של מגיב דיסוציאציה לכל באר.
בזהירות להתבונן במורפולוגיה של התא תחת מיקרוסקופ. כאשר תאי האנדותל נראים בהירים ועגולים, בדרך כלל תוך שתיים עד חמש דקות, נתקו אותם על ידי הקשה על קצה הצלחת. התאים שאינם אנדותל נשארים מחוברים לצלחת.
באמצעות מיקרופיפטה, אספו בזהירות את תאי האנדותל המנותקים מבלי להפריע לתאים שאינם אנדותל, והעבירו אותם לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר או 50 מיליליטר המכיל ארבעה מיליליטר של DMEM/F-12 10 למיליליטר של מגיב דיסוציאציה. לאחר מכן הוסף שני מיליליטר של מדיום HECSR לבארות המכילות את התאים הלא-אנדותליים המחוברים הנותרים כדי לבסס את השריר החלק כמו תאים או SMLCs ומניחים את הצלחת באינקובטור. מעבירים את מתלה תאי האנדותל לתוך צינור צנטריפוגה.
מערבבים היטב ושומרים 10 מיקרוליטר של התרחיף לספירת תאים. צנטריפוגה את התאים הנותרים ב 200 גרם במשך חמש דקות ב 20 עד 25 מעלות צלזיוס. לאחר מכן להוסיף שני מיליליטר של מדיום HECSR.
לאחר מכן, הסר את הקולגן לתמיסה מקודן קולגן שהוכן בעבר עם שש פלטות באר והוסף שני מיליליטר של תרחיף תאי האנדותל לכל באר. לאחר מכן, לדגור על הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני. צביעה אימונופלואורסצנטית של מולקולות צומת תאים דמויות EECM-BMEC כולל claudin-5, occludin ו- VE-cadherin שימשה להערכת מורפולוגיה של התא ונוכחות של צמתים רציפים ובוגרים.
גירוי של תאים דמויי EECM-BMEC שנזרעו על שקופיות תא עם ציטוקינים מעודדי דלקת כגון גורם נמק הגידול אלפא ואינטרפרון גמא מדולל בתווך מותנה נגזר SMLC מווסת את הביטוי של מולקולות הידבקות כגון ICAM-1 ו- VCAM-1. תמונות מייצגות של סמני תאי שריר חלק, כולל אקטין שריר חלק אלפא, קלפונין וחלבון שריר חלק 22 אלפא מוצגות כאן. גירוי של תאים דמויי EECM-BMEC עם ציטוקינים מעודדי דלקת כמו גורם נמק הגידול אלפא ואינטרפרון גמא העלה את ביטוי פני התא של מספר מולקולות הידבקות, כולל ICAM-1, VCAM-1 ו-P-selectin.
יתר על כן, גירוי עם ציטוקינים דלקתיים גם שיפר את הביטוי של מולקולות הידבקות אנדותל וקידם את המספר המוגבר של תאים חיסוניים שנצמדו לחד-שכבות תאים דמויי EECM-BMEC דמויי EECM-BMEC מבטיחים גם להבנה מעמיקה של מנגנונים פתופיזיולוגיים ברמת מחסום הדם-מוח, וככלי רב ערך לפיתוח יעד טיפולי חדש לייצוב מחסום דם-מוח.
