הבנה מלאה של התפקיד שתאי M ממלאים בהומלוסטזיס במעיים ובהגנה החיסונית חסרה, בשל נדירותם של תאי M במעי. ההידול המושרה של תאי M בתאי גזע מעיים אנושיים נגזר תרבויות יאפשרו את המחקר של התפתחות תאי M ותפקודים. כדי לצפות את קרום טרנסוול, למקם את המספר הרצוי של Transwells בצלחת 24 באר, יצירת מערכת שני תאים.
מדללים את המטריצה החוץ-תאית, או ECM, פי 25 בתמיסת מלח סטרילית קרה. לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של פתרון מדולל קר לתוך כל תא עליון על הממברנה. מכסים את צלחת 24 היטב עם מכסה, וממקמים את הצלחת לתוך אינקובטור תרבות רקמות ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים כדי לאפשר את התמצקת ECM על הממברנה.
לאחר שעתיים, מוציאים את הצלחת מהחמה, ומ מניחים במכסה המנוע של תרבות הרקמות. באמצעות פינצטה סטרילית, הפוך כל טרנסוול כדי להסיר בעדינות את הפתרון שנותר. אפשר את הממברנות לאוויר יבש במכסה המנוע עם המכסה פתוח בזמן התאים נאספים.
מוציאים את צלחת האינטרואידים האיליאליים מהאינקובטור, ומסירים בעדינות את מדיית התרבות מכל באר על ידי שאיפת ואקום או עם פיפטה. כדי לשבור את ECM, להוסיף 500 microliters של קרח קר 0.5 מילימולר EDTA לכל באר המכילה enteroids ileal מושעה ECM. פיפטה למעלה ולמטה במרץ עם צינור P1000 להגדיר ב 500 microliters כדי לשבור את ECM, ובכך לשחרר enteroids ileal לתוך הפתרון.
לאסוף את הפתרון מכל גם לתוך 15 צינורות חרוט מיליליטר. גלולה את התאים בצנטריפוגה ב 140G וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. גלולה צריך להיות גלוי, אבל יכול להיות נקע בקלות, כל כך לאט להסיר את העל טבעי על ידי שאיפה ואקום או עם פיפטה.
כדי לעכל קשרים צומת הדוק ולשבור את enteroids ileal לתוך תאים בודדים, להשתמש שוב את גלולה ב 500 microliters של טריפסין טמפרטורת החדר לכל חמש בארות שנאספו. באמצעות צינור P1000, פיפטה למעלה ולמטה כדי לפרק את הגושים. דגירה הצינורות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות או פחות.
הוסף מיליליטר אחד של DMEM מתקדם F-12 עם 10%FPS לכל 500 מיקרוליטר של טריפסין כדי להשבית את טריפסין. פיפטה למעלה ולמטה עם P1000 להגדיר ב 500 microliters לפחות 50 פעמים נגד הצד של הצינור חרוט עוד יותר לרוקן גושים שנותרו לתאים בודדים. מניחים מסננת תא 40 מיקרון מעל צינור חרוט 50 מיליליטר, ומוסיפים מיליליטר אחד של מתקדם DMEM F-12 עם 10% FPS כדי להרטיב את מסננת התא.
פיפטה ההשעיה תא יחיד מן חרוט 15 מיליליטר על מסננת. לשטוף את מסננת עם מיליליטר אחד של מתקדם DMEM F-12 עם 10%FPS. העבר את התאים שעברו מסננת התא מצינור חרוט 50 מיליליטר לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר חדש.
לספור את התאים באמצעות מד חמוציט. צנטריפוגה התאים בצינור החדש 15 מיליליטר ב 400G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. גלולת התא צריכה להיות גלויה.
בזהירות להסיר את supernatant עם פיפטה, שוב שמירת supernatant במקרה גלולה הופך נקע. תן שימוש חוזר לכדור התא ב MCMGF פלוס עם 10 micromolar Y27632. ודא כי הממברנות מקודד ECM התייבשו באופן מלא כפי שהוערך על ידי העין.
לשטוף את התא העליון עם 200 microliters של MCMGF פלוס. לאחר מכן, להוסיף 200 microliters של פתרון התא לתוך כל תא עליון. הוסיפו 700 מיקרוליטרים של MCMGF פלוס עם 10 מיקרומולרים Y27632 לכל תא תחתון.
מניחים את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2. לאחר יום אחד של צמיחה, להסיר את המדיה מהתא העליון, ולהחליף עם 200 microliters של MCMGF טרי פלוס כדי למנוע צמיחה של שכבות תאים מרובים. לאחר monolayers הם כ 80%confluent, בדרך כלל בין ימים אחד עד שלושה זריעת פוסט, להחליף מדיה basilateral עם מדיה בידול עבור בארות שליטה, או עם מדיה תא M עבור בארות אינדוקציה תא M.
החלף את המדיה בתא העליון במדיה של התברואה עבור שני התנאים. כדי לאמת התמדיר תא M על-ידי QRTPCR, הסר תחילה את המדיה מהתא העליון והתחתון. לשטוף בעדינות את התא העליון פעמיים עם 300 microliters של PPS טמפרטורת החדר.
מוסיפים 300 מיקרוליטרים של TRIzol לכל תא עליון, ו דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. בינתיים, תווית צינורות מיקרו צנטריפוגה עבור כל באר, ולהוסיף 700 microliters של TRIzol לכל צינור. לאסוף הומוגניט תאים על ידי צינור בעדינות למעלה ולמטה שלוש פעמים עם P1000, ולהעביר את התוכן לתוך צינורות מיקרו צנטריפוגה המתאימים.
וורטקס לחמש שניות לערבב. שמור את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות נוספות ולאחר מכן המשך עם פרוטוקולי QRTPCR סטנדרטיים, או אחסן דגימות בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס. כדי לאמת את התמדימות תאי M על-ידי שפעת חיסונית, הסר תחילה את המדיה מהתא העליון.
יש לשטוף בעדינות פעמיים עם 300 מיקרוליטרים של PBS בטמפרטורת החדר. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של טמפרטורת החדר 4%PFA ב-PBS לתא העליון. מכסים את הצלחת בנייר כסף ולתת לעמוד במשך 25 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר הסרת PFA, לשטוף את התא העליון שלוש פעמים עם 300 microliters של PBS טמפרטורת החדר. הדגירה monolayers עם 100 microliters של 5% BSA מומס PBS במשך 30 דקות בחושך בטמפרטורת החדר כדי לחסום את monolayers לפני הסרת הפתרון. הכינו את פתרון הנוגדנים העיקרי של GP2 באחוז אחד של BSA ב-PBS בדילול של 1 עד 100, והוסיפו 100 מיקרוליטרים ל הבאר.
מכתימים במשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך, לפני הסרת הפתרון. לשטוף את התא העליון שלוש פעמים עם 300 microliters של PBS טמפרטורת החדר. הכן פתרון כתם משני של IgG פאלודין ו-DAPI מתויגים פלואורסצנטיים, והוסף 100 מיקרוליטרים ל באר.
כתם במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לשטוף את בארות שלוש פעמים עם 300 microliters של PBS. לאחר מכן, מניחים טיפת חמישה מיקרוליטר של פתרון הרכבה על מגלשת זכוכית.
הסר את באר מן צלחת 24 היטב להפוך. במהלך הסרת הממברנה מהטרנסוול, הממברנה חייבת להישאר שטוחה לחלוטין. בליטות בממברנה מונעות אטם מוצק לשקופית הזכוכית, והן יכולות להשפיע מאוד על איכות התמונה.
כדי להבטיח הצלחה, בזהירות לחתוך את הממברנה מן הבאר באמצעות אזמל חד. מניחים את הממברנה עם התאים הפונים כלפי מעלה על טיפת פתרון ההרכבה על מגלשת הזכוכית. מוסיפים 10 מיקרוליטרים של תותב הרכבה על החלק העליון והמרכזי של הממברנה, ומציבים תלוש כיסוי על גבי כדי לאטום את הממברנה בין מגלשת הזכוכית להחליק כיסוי.
יבש את המגלשות בטמפרטורת החדר בחושך במשך 24 שעות. תאי M מזוהים על ידי ביטוי פני השטח של GP2 על ידי immunofluorescents. בדרך כלל, ב monolayer confluent, אחד עד חמישה תאים M נצפו בשדה מיקרוסקופ נתון בהגדלה 40X על ידי ימים שישה עד שמונה זריעת פוסט בדגימות שטופלו RANKL ו TNF אלפא.
לא נראה ביטוי GP2 בדגימות שאינן מטופלות. התצוגה האורגזמית של מישור ה-XZ מכוסה בגשוש פאלואין מראה מבני אקטין המקיפים כל תא, וביטוי GP2 על פני השטח האפטיים של תאי M. מודל זה מסכם את התדירות הנמוכה של תאי M שנמצאו במעי האנושי.
כדי לקבוע אם תאי M שפותחו במודל זה מסוגלים להיקשר ל- IgA, נוכחותו של IgA בתאי M מתדמית באמצעות נוגדן משני נדוש פלואור המזהה את השרשרת הכבדה של סרום אנושי IgA. תאי M שטופלו ב- IgA במשך שעה אחת קשורים IgA לפני השטח של האפים, ואילו לתאי M בארות בקרה שטופלו רק בנוגדן המשני ל- IgA, אין אות ניתן לגילוי. יתר על כן, IgA במיוחד נקשר לפני השטח apical של תאי M, והוא לא נמצא קשור לכל התאים חסר כתם משטח GP2.
בנוסף, לתאי M יש פעולה צפופה קצרה יותר באופן אופייני על פני השטח שלהם. מעבר למדיית ההתברמות של RANKL TNF בתוספת דיפרציה כאשר המונו-שכבות הן בסביבות 80%confluent, הוא המפתח להשגת התדליות טובה של תאי M. טכניקה זו תאפשר לחוקרים לחקור שאלות הקשורות להתפתחות תאי M, כמו גם אינטראקציות פתוגן מארחות ומחקרי הובלת סמים המערבים תאי M.
