Ein vollständiges Verständnis der Rolle, die die M-Zellen bei der Darmhomöostase spielen, und die Immunabwehr fehlt aufgrund der Seltenheit von M-Zellen im Darm. Die induzierte Differenzierung von M-Zellen in menschlichen Darmstammzell-abgeleiteten Kulturen ermöglicht die Untersuchung der M-Zellentwicklung und -funktionen. Um die Transwell-Membranen zu beschichten, legen Sie die gewünschte Anzahl von Transwells in eine 24-Well-Platte, wodurch ein Zweikammersystem entsteht.
Verdünnen Sie die extrazelluläre Matrix, oder ECM, 25-fach in kaltsteriler Phosphat gepufferte Saline. Dann 100 Mikroliter kaltverdünnte Lösung in jede obere Kammer auf die Membran geben. Bedecken Sie die 24 Brunnenplatte mit einem Deckel, und legen Sie die Platte in einen Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden, um die ECM-Erstarrung auf der Membran zu ermöglichen.
Nach zwei Stunden, entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator, und legen Sie in einer Gewebekultur Haube. Mit steriler Pinzette, invertieren Sie jeden Transwell, um die verbleibende Lösung vorsichtig zu entfernen. Lassen Sie die Membranen in der Haube trocknen, während sich der Deckel öffnet, während Zellen gesammelt werden.
Entfernen Sie die Platte der ilealen Enteroide aus dem Inkubator, und entfernen Sie vorsichtig die Kulturmedien aus jedem Brunnen durch Vakuumaspiration oder mit einer Pipette. Um das ECM aufzubrechen, fügen Sie 500 Mikroliter eiskalte seiskalte Seiskalte seiskalte EDTA zu jedem Brunnen hinzu, der ileale Enteroide enthält, die im ECM ausgesetzt sind. Pipette kräftig nach oben und unten mit einem P1000 Pipetter auf 500 Mikroliter, um ECM aufzubrechen, wodurch ileale Enteroide in die Lösung freigesetzt werden.
Sammeln Sie die Lösung von jedem Brunnen in 15 Milliliter konische Röhren. Pellet die Zellen in einer Zentrifuge bei 140G und vier Grad Celsius für fünf Minuten. Pellet sollte sichtbar sein, kann aber leicht entfernt werden, so langsam entfernen Sie den Überstand durch Vakuumaspiration oder mit einer Pipette.
Um enge Knotenpunkte zu verdauen und die ilealen Enteroide in einzelne Zellen aufzuteilen, setzen Sie das Pellet in 500 Mikroliter Raumtemperatur Trypsin pro fünf gesammelten Brunnen wieder auf. Mit einem P1000 Pipetter, Pipette nach oben und unten, um die Klumpen zu disaggregieren. Inkubieren Sie die Rohre in einem 37 Grad Celsius Wasserbad für fünf Minuten oder weniger.
Fügen Sie einen Milliliter fortgeschrittenedmEM F-12 mit 10%FPS pro 500 Mikroliter Trypsin hinzu, um das Trypsin zu inaktivieren. Pipette nach oben und unten mit einem P1000 auf 500 Mikroliter mindestens 50 Mal gegen die Seite des konischen Rohres, um weitere Disaggregieren verbleibende Klumpen in einzelne Zellen. Legen Sie ein 40 Mikron Zellsieb über ein 50 Milliliter konisches Rohr, und fügen Sie einen Milliliter fortschrittliche DMEM F-12 mit 10%FPS, um das Zellsieb zu befeuchten.
Pipette die Einzelzellsuspension von der 15 Milliliter konischen auf das Sieb. Waschen Sie das Sieb mit einem Milliliter fortschrittlicher DMEM F-12 mit 10%FPS. Übertragen Sie die Zellen, die durch das Zellsieb aus dem 50 Milliliter konischen Rohr ging, in eine neue 15 Milliliter konische Röhre.
Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Zentrifugieren Sie die Zellen in der neuen 15-Milliliter-Röhre bei 400G für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Das Zellpellet sollte sichtbar sein.
Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette und retten Sie den Überstand erneut, falls das Pellet ausfällt. Setzen Sie das Zellpellet in MCMGF plus mit 10 Mikromolaren Y27632 wieder auf. Stellen Sie sicher, dass die ECM-codierten Membranen vollständig getrocknet sind, wie vom Auge beurteilt.
Waschen Sie die obere Kammer mit 200 Mikroliter MCMGF plus. Fügen Sie dann 200 Mikroliter Zelllösung in jede obere Kammer. Fügen Sie 700 Mikroliter MCMGF plus mit 10 Mikromolaren Y27632 zu jeder unteren Kammer hinzu.
Legen Sie die Platte in einen 37 Grad Celsius Gewebekultur-Inkubator mit 5%CO2. Nach einem Tag des Wachstums, entfernen Sie die Medien aus der oberen Kammer, und ersetzen Sie durch 200 Mikroliter frische MCMGF plus, um das Wachstum von mehreren Zellschichten zu verhindern. Sobald Monolayer etwa 80% konfluent sind, in der Regel zwischen Tagen eins bis drei nach der Aussaat, ersetzen Basilateralmedien durch Differenzierungsmedien für Kontrollbrunnen oder durch M-Zellmedien für M-Zell-Induktionsbrunnen.
Ersetzen Sie die Medien in der oberen Kammer durch Differenzierungsmedien für beide Bedingungen. Um die M-Zellendifferenzierung durch QRTPCR zu überprüfen, entfernen Sie zuerst die Medien aus den oberen und unteren Kammern. Waschen Sie die obere Kammer zweimal mit 300 Mikroliter Raumtemperatur PPS.
Fügen Sie 300 Mikroliter TRIzol in jede obere Kammer und inkubieren bei Raumtemperatur für fünf Minuten. In der Zwischenzeit Mikrozentrifugenrohre für jeden Brunnen beschriften und 700 Mikroliter TRIzol zu jedem Rohr hinzufügen. Sammeln Sie die Zellhomogenisierung, indem Sie mit einem P1000 dreimal sanft nach oben und unten pfeifen und den Inhalt in entsprechende Mikrozentrifugenrohre übertragen.
Wirbel für fünf Sekunden zu mischen. Bewahren Sie die Proben für weitere drei Minuten bei Raumtemperatur auf, und fahren Sie dann mit Standard-QRTPCR-Protokollen fort, oder lagern Sie Proben bei negativen 80 Grad Celsius. Um die M-Zell-Differenzierung durch Immunfluoreszenz zu überprüfen, entfernen Sie zunächst das Medium aus der oberen Kammer.
Zweimal mit 300 Mikroliter Raumtemperatur PBS vorsichtig waschen. Fügen Sie 100 Mikroliter Raumtemperatur 4%PFA in PBS in die obere Kammer. Die Platte mit Folie bedecken und 25 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen.
Nach dem Entfernen des PFA, waschen Sie die obere Kammer dreimal mit 300 Mikroliter Raumtemperatur PBS. Inkubieren Sie die Monolayer mit 100 Mikrolitern 5%BSA, die in PBS gelöst sind, 30 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur, um die Monolayer zu blockieren, bevor die Lösung entfernt wird. Bereiten Sie gp2 primäre Antikörperlösung in einem Prozent BSA in PBS bei einer Verdünnung von eins bis 100, und fügen Sie 100 Mikroliter pro Brunnen.
Beflecken Sie für eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln, bevor Sie die Lösung entfernen. Waschen Sie die obere Kammer dreimal mit 300 Mikroliter Raumtemperatur PBS. Bereiten Sie eine sekundäre Fleckenlösung mit fluoreszierend getaggter Ziege IgG Phalloidin und DAPI vor und fügen Sie 100 Mikroliter pro Brunnen hinzu.
30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln färben. Waschen Sie die Brunnen dreimal mit 300 Mikroliter PBS. Legen Sie dann einen 5-Mikroliter-Tropfen Der Montagelösung auf eine Glasrutsche.
Entfernen Sie den Brunnen von der 24 Well Platte und invertieren. Beim Entfernen der Membran aus dem Transwell muss die Membran vollständig flach bleiben. Stöße in der Membran verhindern eine feste Abdichtung des Glasschlittens und können die Bildqualität stark beeinträchtigen.
Um den Erfolg zu gewährleisten, schneiden Sie die Membran vorsichtig aus dem Brunnen mit einem scharfen Skalpell. Legen Sie die Membran mit den Zellen nach oben auf das Tröpfchen der Montagelösung auf dem Glasschlitten. Fügen Sie 10 Mikroliter Montagelösung auf die Oberseite und Mitte der Membran, und legen Sie einen Deckel-Schlupf auf die Oberseite, um die Membran zwischen dem Glasschlitten und Abdeckung Schlupf zu versiegeln.
Trocknen Sie die Dias bei Raumtemperatur im Dunkeln für 24 Stunden. M-Zellen werden durch Oberflächenexpression von GP2 durch Immunfluoreszenzen detektiert. Typischerweise werden in einer konfluenten Monoschicht ein bis fünf M-Zellen in einem gegebenen Mikroskopfeld bei 40-facher Vergrößerung durch Tage sechs bis acht in Proben beobachtet, die mit RANKL und TNF alpha behandelt wurden.
In den unbehandelten Proben ist kein GP2-Ausdruck zu sehen. Die orthogonale Ansicht der XZ-Ebene, die mit einer Phalloidinsonde überlagert ist, zeigt Aktinstrukturen, die jede Zelle umgeben, und die GP2-Expression auf der apikalen Oberfläche von M-Zellen. Dieses Modell rekapituliert die geringe Häufigkeit von M-Zellen im menschlichen Darm gefunden.
Um festzustellen, ob die in diesem Modell entwickelten M-Zellen in der Lage sind, sich an IgA zu binden, wird das Vorhandensein von IgA auf M-Zellen mit einem fluorkonjugierten Sekundärantikörper visualisiert, der die schwere Kette des menschlichen Serums IgA erkennt. M-Zellen, die eine Stunde lang mit IgA behandelt wurden, haben IgA an die apikale Oberfläche gebunden, während M-Zellen in Kontrollbrunnen, die nur mit dem sekundären Antikörper gegen IgA behandelt wurden, kein nachweisbares Signal haben. Darüber hinaus bindet IgA speziell an die apikale Oberfläche von M-Zellen und wird nicht an Zellen ohne GP2-Oberflächenfleck gebunden gefunden.
Darüber hinaus haben M-Zellen charakteristisch kürzere dichte Actin auf ihrer apikalen Oberfläche. Der Wechsel zu RANKL TNF alpha-ergänzungsdifferenzierungsmedien, wenn die Monolayer um 80 % konfluent sind, ist der Schlüssel zu einer guten M-Zelldifferenzierung. Diese Technik wird es Forschern ermöglichen, Fragen im Zusammenhang mit der Entwicklung von M-Zellen zu untersuchen, sowie Wirtspathogen-Wechselwirkungen und Arzneimitteltransportstudien mit M-Zellen.
