وهناك فهم كامل للدور الذي تلعبه الخلايا M في التوازن المعوي والدفاع المناعي غير موجود ، نظرًا لندرة خلايا M في الأمعاء. التمايز المستحث للخلايا M في الثقافات الجذعية البشرية المشتقة من الخلايا الجذعية المعوية سيسمح لدراسة تطوير الخلية M ووظائفها. لمعطف أغشية ترانسويل، ضع العدد المطلوب من Transwells في لوحة 24 بئر، وخلق نظام غرفة اثنين.
تخفيف المصفوفة خارج الخلية، أو ECM، 25 أضعاف في الفوسفات العقيمة الباردة المالحة المخزنة. ثم، إضافة 100 ميكرولترات من محلول المخفف الباردة في كل غرفة عليا على الغشاء. غطي 24 بئراً بغطاء، ووضعي الطبق في حاضنة لثقافة الأنسجة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعتين للسماح بتكليس ECM على الغشاء.
بعد ساعتين، وإزالة لوحة من الحاضنة، ووضع في غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة. باستخدام ملاقط معقمة، عكس كل Transwell لإزالة بلطف الحل المتبقية. السماح للأغشية للهواء الجاف في غطاء محرك السيارة مع غطاء مفتوح بينما يتم جمع الخلايا.
إزالة لوحة من الاصنايد ileal من الحاضنة، وإزالة بلطف وسائل الإعلام الثقافة من كل بئر عن طريق التطلع فراغ أو مع ماصة. لتفريق ECM، إضافة 500 ميكرولترات من الجليد البارد 0.5 ملليمولار EDTA إلى كل بئر تحتوي على المعويات ileal علقت في ECM. pipette صعودا وهبوطا بقوة مع أنبوب P1000 تعيين في 500 ميكرولتررس لتفريق ECM، وبالتالي الإفراج عن المعويات ileal في الحل.
جمع الحل من كل بئر في أنابيب مخروطية 15 ملليلتر. بيليه الخلايا في جهاز طرد مركزي في 140G وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. بيليه ينبغي أن تكون مرئية، ولكن يمكن إزاحة بسهولة، حتى إزالة ببطء supernatant عن طريق طموح فراغ أو مع ماصة.
لهضم الروابط الضيقة تقاطع وتفتيت المعويات ileal في خلايا واحدة، resuspend بيليه في 500 ميكرولترات من التربسين درجة حرارة الغرفة لكل خمسة آبار تم جمعها. باستخدام أنبوب P1000، ماصة صعودا وهبوطا لتصنيف كتل. احتضان الأنابيب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق أو أقل.
إضافة ملليلتر واحد من متقدمة DMEM F-12 مع 10٪ FPS لكل 500 ميكرولترات من التربسين لإلغاء تنشيط التربسين. الماصات صعودا وهبوطا مع مجموعة P1000 في 500 ميكرولترس على الأقل 50 مرات ضد جانب الأنبوب المخروطي لمزيد من تقسيم الكتل المتبقية في خلايا واحدة. ضع مصفاة 40 ميكرون خلية على أنبوب مخروطي 50 ملليلتر، وإضافة ملليلتر واحد من DMEM F-12 المتقدمة مع 10٪ FPS لتبلل مصفاة الخلية.
Pipette تعليق خلية واحدة من 15 ملليلتر مخروطي على مصفاة. غسل مصفاة مع ملليلتر واحد من متقدمة DMEM F-12 مع 10٪ FPS. نقل الخلايا التي ذهبت من خلال مصفاة الخلية من أنبوب مخروطي 50 ملليلتر إلى أنبوب مخروطي جديد 15 ملليلتر.
عد الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيت. الطرد المركزي الخلايا في أنبوب 15 ملليلتر الجديد في 400G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. يجب أن تكون خلية بيليه مرئية.
إزالة بعناية فائقة مع ماصة، إنقاذ مرة أخرى من افرنح في حالة بيليه يصبح طرد. Resuspend بيليه الخلية في MCMGF بالإضافة إلى 10 ميكرومولار Y27632. تأكد من أن الأغشية المرمزة في ECM قد جفت بالكامل كما تم تقييمها بالعين.
غسل الغرفة العليا مع 200 ميكرولترات من MCMGF زائد. ثم، إضافة 200 ميكرولترات من حل الخلية في كل غرفة العليا. أضف 700 ميكرولترات من MCMGF بالإضافة إلى 10 ميكرومولار Y27632 لكل غرفة أدنى.
ضع الطبق في حاضنة استزراع الأنسجة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد يوم واحد من النمو، وإزالة وسائل الإعلام من الغرفة العليا، واستبدالها مع 200 ميكرولترات من MCMGF جديدة بالإضافة إلى منع نمو طبقات الخلايا المتعددة. مرة واحدة monolayers هي ما يقرب من 80٪ التقاء، وعادة بين أيام واحد إلى ثلاثة البذر وظيفة، استبدال وسائل الإعلام الريحية مع وسائل الإعلام التمايز لآبار التحكم، أو مع وسائل الإعلام الخلية M لآبار التعريفي الخلية M.
استبدال الوسائط في الغرفة العليا بوسائط تمييز لكلا الحالتين. للتحقق من تمييز الخلية M بواسطة QRTPCR، قم أولاً بإزالة الوسائط من الغرف العلوية والسفلية. غسل بلطف الغرفة العليا مرتين مع 300 ميكرولترات من درجة حرارة الغرفة PPS.
إضافة 300 ميكرولتر من TRIzol إلى كل غرفة العليا، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. وفي الوقت نفسه، تسمية أنابيب أجهزة الطرد المركزي الصغيرة لكل بئر، وإضافة 700 ميكرولتر من TRIzol إلى كل أنبوب. جمع تجانس الخلية عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا ثلاث مرات مع P1000، ونقل محتويات في أنابيب أجهزة الطرد المركزي الصغيرة المقابلة.
دوامة لمدة خمس ثوان لخلط. الاحتفاظ بالعينات في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق إضافية، ثم تابع مع بروتوكولات QRTPCR القياسية، أو تخزين العينات في درجة مئوية سالبة 80. للتحقق من تمايز الخلية M بواسطة الفلورس المناعية، أولاً، إزالة الوسائط من الغرفة العليا.
غسل بلطف مرتين مع 300 ميكرولترات من درجة حرارة الغرفة PBS. إضافة 100 ميكرولترات من درجة حرارة الغرفة 4٪ PFA في برنامج تلفزيوني إلى الغرفة العليا. غطي الطبق بالرقائق واتدعه يقف لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
بعد إزالة PFA، وغسل الغرفة العليا ثلاث مرات مع 300 ميكرولترات من درجة حرارة الغرفة PBS. احتضان monolayers مع 100 ميكرولترات من 5٪ BSA حل في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمنع monolayers قبل إزالة الحل. إعداد الحل GP2 الأجسام المضادة الأولية في واحد في المئة BSA في برنامج تلفزيوني في تخفيف من واحد إلى 100، وإضافة 100 ميكرولترات في البئر.
وصمة عار لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام، قبل إزالة الحل. غسل الغرفة العليا ثلاث مرات مع 300 ميكرولترات من درجة حرارة الغرفة PBS. إعداد حل وصمة عار الثانوية من الماعز الموسومة الفلورسنت المضادة للماوس IgG phalloidin وDAPI، وإضافة 100 ميكرولترات في البئر.
وصمة عار لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. اغسل الآبار ثلاث مرات مع 300 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني. ثم، ضع قطرة مصغرة خمسة من حل التركيب على شريحة زجاجية.
إزالة البئر من لوحة 24 جيدا وعكس. أثناء إزالة الغشاء من ترانسويل ، يجب أن يظل الغشاء مسطحًا تمامًا. المطبات في الغشاء منع ختم ثابت إلى الشريحة الزجاجية، ويمكن أن تؤثر بشكل كبير على جودة الصورة.
لضمان النجاح، قطع بعناية الغشاء من البئر باستخدام مشرط حاد. وضع الغشاء مع الخلايا التي تواجه حتى على قطرة من تصاعد الحل على الشريحة الزجاجية. إضافة 10 ميكرولترات من حل تصاعد على الجزء العلوي ومركز الغشاء، ووضع زلة غطاء على رأس لختم الغشاء بين الشريحة الزجاجية وزلة الغطاء.
جفف الشرائح في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 24 ساعة. يتم الكشف عن الخلايا M عن طريق التعبير السطحي لـ GP2 بواسطة الفلورسنتات المناعية. عادة، في أحادية النقوش، واحد إلى خمسة خلايا M لوحظ في حقل مجهر معين في التكبير 40X من قبل أيام ستة من خلال ثمانية بعد البذر في العينات تعامل مع رانكل و TNF ألفا.
لا يوجد تعبير GP2 هو ينظر في العينات غير المعالجة. عرض متعامد من الطائرة XZ مضاف مع مسبار phalloidin يظهر هياكل actin المحيطة كل خلية، وتعبير GP2 على سطح apical من الخلايا M. يلخص هذا النموذج التردد المنخفض للخلايا M الموجودة في الأمعاء البشرية.
لتحديد ما إذا كانت الخلايا M المتقدمة في هذا النموذج قادرة على ربط IgA، يتم تصور وجود IgA على الخلايا M باستخدام جسم مضاد ثانوي مترافق فلوراً يتعرف على السلسلة الثقيلة من مصل الإنسان IgA. الخلايا M تعامل مع IgA لمدة ساعة واحدة لها IgA ملزمة إلى السطح apical، في حين أن الخلايا M في الآبار التحكم التي تم التعامل فقط مع الأجسام المضادة الثانوية إلى IgA، ليس لديها إشارة يمكن الكشف عنها. علاوة على ذلك، IgA يرتبط على وجه التحديد إلى السطح apical من الخلايا M، وليس منضما إلى أي خلايا تفتقر إلى وصمة عار سطح GP2.
وبالإضافة إلى ذلك، خلايا M لها بشكل مميز اقصر actin الكثيفة على سطحها apical. التحول إلى رانكل TNF ألفا تكمل وسائل الإعلام التمايز عندما monolayers حوالي 80٪ التقاء، هو المفتاح لتحقيق جيد M الخلية التمايز. هذه التقنية سوف تسمح للباحثين لاستكشاف الأسئلة المتعلقة بتطوير الخلايا M، فضلا عن التفاعلات المسببة للأمراض المضيفة ودراسات نقل المخدرات التي تشمل الخلايا M.
