פרוטוקול זה מאפשר לנו לזהות מסלולי הנחיית אקסון הפעילים בעצב oculomotor ולהעריך את תפקידם בנקודות שונות לאורך מסלול העצבים בזמן אמת. טכניקה זו משמרת את הסביבות המקומיות שדרך אקסונים נוסעים ואת המטרות הסופיות שלהם. האקסונים הגדלים אינם נחתכים, ולכן ניתן להעריך את גידול האקסון הראשוני, ולא את ההתחדשות.
שיטה זו מספקת תובנות על הדרכה אקסון במערכת המנוע העין אבל יכול להיות מותאם לחקר הדרכה אקסון של עצבים אחרים. טכניקה זו דורשת תרגול כדי לשלוט, ולעבוד במהירות היא חשובה ביותר. כאשר מנסים את זה בפעם הראשונה, להשתמש רק כמה עוברים, ולא המלטה שלמה.
לפני תחילת ההליך, ראשית לאשר את ההריון על ידי אולטרסאונד ביום עוברי 10.5 מהזדווגות מתוזמן. לקצור את העוברים, לרסס את הבטן של העכבר בהריון עם 70% אתנול, ולהשתמש מספריים כדי לפתוח את חלל הבטן כדי לחלץ את הרחם. לשטוף את הרחם בצלחת פטרי של HBSS קר כקרח לפני הנחת האיבר בצלחת פטרי שנייה של HBSS קר כקרח טרי.
תחת היקף ניתוח, להסיר את העוברים מן קרן הרחם ושיקי מי האמון האישיים שלהם, הצבת כל עובר על החלק התחתון של המכסה של צלחת 12 באר, על קרח, כפי שהם שנקטפו. השתמש בנייר סינון כדי להסיר כל נוזל המקיף כל עובר, מבלי לגעת בעוברים עצמם, ולהטביע את העוברים ב- agarose נוזלי 4% נמס נמוך. מניחים את מכסה הצלחת על הקרח כדי לחזק את ההתעוררות.
כאשר agarose התקשה, להפוך את העוברים לכסות את הצד השני של כל מדגם עם אגרוז נוסף. כאשר הנפח השני של אגרוז התגבש, השתמש במיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי כדי לקצץ את ההתעוררות סביב כל עובר, כך שכל עובר יהיה מכוון כראוי על שלב הרטט. הגרעינים oculomotor ו חקלאות אקסון מוקדם צריך להיות פלואורסצנטי.
יישר כל עובר כך שהגרעין, האקסונים הצומחים והעין יוצרים קו, ולהשתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את ההתעוררות המקבילה לקו זה. לאחר מכן, מלאו את תא הרטט במאגר פרוסות קר כקרח, והדביקו את העובר הראשון לשלב הרטט כך שהלהב יהיה מקביל לגרעין ולעיניים של oculomotor. כאשר דבק העל יבש, הטביעו את שלב הרטט כך שהעובר יהיה מכוון הרחק מהלהב, ולהשתמש בלהב רטט חדש כדי להשיג פרוסות 400 עד 450 מיקרומטר.
השתמש פיפטה העברה סטרילית להעביר כל פרוסה לתוך חיץ חיתוך קר כפי שהוא נרכש, ולהשתמש במיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי כדי לבחור את הפרוסה המכילה את הגרעינים oculomotor ועיניים. בעזרת פיפטה להעברה סטרילית, מעבירים את הפרוסה לתרבות תאים בצלחת בת שש בארות המכילה 1.5 מיליליטר של מדיום תרבותי ל הבאר, ומכניסים את הצלחת לחממה של 37 מעלות צלזיוס. מוציאים את השאריות מהשלב הויברטום, ומדביקים את העובר הבא על הבמה, וממשיכים לאסוף פרוסות עד שכל העוברים נחתכו וצפו.
לאחר מכן מוסיפים את הריכוז המתאים של מעכב או מולקולה רקומביננטי של עניין, מדולל ממס מתאים, למדיום של כל באר. צור עקומת תגובת מינון. תדמיין את הפרוסות כל 30 דקות לפי ניגודיות פאזה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית למשך עד 72 שעות.
במהלך נורמלי בהתפתחות ברחם, האקסונים החדשים הראשונים של חלבון פלואורסצנטי חיובי oculomotor להגיע למסלול על ידי יום עוברי 11.5 לפני הסתעפות ליעדים הסופיים שלהם, כפי שנצפה בתרבות פרוסה מייצגת זו. כיוון הפרוסה בשלב הרטט הוא קריטי, כיוון שהפרוסות אינן ניתנות לפרשנות אם הן אינן מכוונות כראוי. לדוגמה, אם העובר מוטה לצדו, רק גרעין oculomotor אחד יצפה בתוך הפרוסה.
אם העובר המוטבע מוטה רחוק מדי לכיוון גבו, העיניים לא יהיו קיימות בתוך הפרוסה, ובמקום זאת ניתן לכלול את הגפיים העליונות ואת ההידברות או חוט השדרה. חשוב גם לדאוג כי במהלך המיקום של הפרוסה על קרום התרבות, כי הרקמה לא להיות מקופל. יש לדאוג בעת המסת המעכבים וגורמי גדילה ממיסים אורגניים.
לדוגמה, בניסוי זה, הפרוסה מתה לאחר הוספת אתנול למדיום. זכור לשמור הכל על הקרח כדי למזער את הזמן בין החילוץ של העוברים והנחת הפרוסות באינקובטור. באמצעות טכניקה זו, התחלנו לזהות מנגנוני הנחיה אקסון נוספים בעבודה במערכת המנוע העין.
זכור לנקוט זהירות בעת עבודה עם סכיני גילוח, כי מעכבים מסוימים עלולים להיות מסוכנים ויש לטפל בזהירות על פי פרופילי הבטיחות שלהם.
