このプロトコルは、眼神経神経で活性な軸索誘導経路を同定し、リアルタイムで神経軌道に沿った異なる点での役割を評価することを可能にする。この手法は、軸索が移動するローカル環境と最終目標を維持します。成長する軸索は切断されないので、再生ではなく最初の軸索の成長を評価することができます。
この方法は、眼運動系における軸索誘導に関する洞察を提供するが、他の神経の軸索誘導の研究に適応することができる。このテクニックは、習得するために練習を必要とし、迅速に作業することは非常に重要です。初めて試すときは、ゴミ全体ではなく、わずか数個の胚を使用してください。
処置を開始する前に、まず、時交から胚10.5日目に超音波で妊娠を確認する。胚を収穫し、妊娠中のマウスの腹部に70%エタノールを吹き付け、そしてはさみを使って腹腔を開けて子宮を抽出する。新鮮な氷冷HBSSの第二のペトリ皿に臓器を入れる前に、氷冷HBSSのペトリ皿で子宮を洗います。
解剖スコープの下で、子宮角とその個々の羊膜嚢から胚を取り除き、各胚を12ウェルプレートの蓋の下側に置き、収穫する。濾紙を使用して、胚自体に触れることなく、各胚を取り巻く液体を除去し、4%低融解アガロースの液体中に胚を水没させます。氷の上にプレートの蓋を置き、アガロースを固めます。
アガロースが硬化したら、胚をひっくり返し、各サンプルの反対側を追加のアガロースで覆う。アガロースの第2の体積が固まったら、各胚がビブラートの段階で適切に配向されるように、各胚の周りにアガロースをトリミングするために蛍光解剖顕微鏡を使用する。オキュロモーター核と初期軸索の成長は蛍光であるべきである。
各胚を整列させ、核、成長する軸索、および目が線を形成するようにし、カミソリの刃を使用してこの線に平行にアガロースをトリミングする。次に、ビブラートメチャンバーに氷冷スライスバッファーを充填し、最初の胚をビブラームステージにスーパーグルーして、ブレードが眼球運動核および眼と平行になるようにします。スーパーグルーが乾燥したら、ビブラートのステージを浸し、胚がブレードから離れて向くようにし、新しいビブラートメブレードを使用して400〜450マイクロメートルのスライスを得る。
滅菌移動ピペットを使用して、各スライスを取得時に冷たいスライスバッファーに移し、蛍光解剖顕微鏡を使用して、オキュロモーター核および眼を含むスライスを選択します。滅菌移動ピペットを使用して、1.5ミリリットルの培養培地を含む6ウェルプレート内の細胞培養インサートにスライスを移し、プレートを37°Cインキュベーターに入れる。ビブラートメステージから残ったアガロースを取り除き、次の胚をステージにスーパーグルーし、すべての胚が切り離されメッキされるまでスライスを収集し続けます。
次に、目的の阻害剤または組換え分子の適切な濃度を加え、適切な溶媒に希釈し、各ウェルの培地に添加する。線量応答曲線を作成します。スライスを相コントラストと蛍光顕微鏡で30分ごとに最大72時間画像化します。
子宮内正常な開発中に、この代表的なスライス培養で観察されるように、最初の緑色蛍光タンパク質陽性眼運動軸索は、最終標的に分岐する前に胚性11.5日目までに軌道に到達する。ビブラートのステージ上のスライスの向きは、それらが正しく向いていない場合、スライスが解釈できないので、重要です。例えば、胚がその側に傾いている場合、スライス内で1つの眼運動核のみが観察される。
埋め込まれた胚が背中に向かって傾き過ぎると、目はスライス内に存在せず、代わりに上肢と後脳または脊髄が含まれる可能性があります。また、スライスを培養膜に配置する際に、組織が折り畳まれないように注意することも重要です。有機溶剤中の阻害剤や成長因子を溶解する際には注意してください。
例えば、この実験では、スライスは培地にエタノールを添加した後に死んだ。氷の上にすべてを維持し、胚の抽出とインキュベーターにスライスを配置する時間を最小限に抑えることを忘れないでください。この技術を用いて、眼運動システムで働く軸索誘導機構を同定し始めた。
カミソリの刃を扱うときは注意して、一部の阻害剤は危険であり、安全プロファイルに従って慎重に取り扱う必要があります。
