이 프로토콜은 우리가 oculomotor 신경에서 활성화된 축축안내 통로를 확인하고 신경 궤적을 따라 다른 지점에서 그들의 역할을 실시간으로 평가할 수 있게 합니다. 이 기술은 축축이 이동하는 로컬 환경과 최종 목표를 보존합니다. 성장하는 축축은 절단되지 않으므로 초기 축축은 재생이 아닌 초기 축축을 평가할 수 있습니다.
이 방법은 안구 모터 시스템의 축 하 안내에 대 한 통찰력을 제공 하지만 다른 신경의 축 하 지침의 연구에 적응 될 수 있습니다. 이 기술은 마스터 연습을 소요하고, 신속하게 작업하는 것은 매우 중요하다. 처음으로 그것을 시도할 때, 전체 쓰레기보다는 단지 몇 개의 배아를 사용하십시오.
절차를 시작하기 전에, 먼저 시간 제짓 짝짓기에서 배아 일 10.5에 초음파에 의한 임신을 확인하십시오. 배아를 수확하고, 임신한 마우스의 복부를 70%에탄올로 분사하고, 가위를 사용하여 복강을 열어 자궁을 추출한다. 신선한 얼음 차가운 HBSS의 두 번째 페트리 접시에 오르간을 배치하기 전에 얼음 차가운 HBSS의 페트리 접시에 자궁을 씻어.
해부 범위 하에서, 자궁 뿔과 그들의 개별 양수 낭에서 배아를 제거, 그들은 수확으로, 얼음에, 12 웰 플레이트의 뚜껑의 아래쪽에 각 배아를 배치. 필터 용지를 사용하여 배아를 스스로 만지지 않고 각 배아를 둘러싼 액체를 제거하고 배아를 액체 4% 저용 아가로즈에 담급하십시오. 접시 뚜껑을 얼음 위에 놓아 아가로즈를 고화시합니다.
아가로즈가 굳어지면 배아위로 뒤집어 각 시료의 반대편을 추가 아가로즈로 덮습니다. 아가로즈의 두 번째 부피가 고화되면 각 배아 주위의 아가로즈를 다듬기 위해 형광 해부 현미경을 사용하여 각 배아가 진동 단계에서 올바르게 지향되도록 합니다. 오큘로모터 핵과 초기 축축기 의 성장은 형광이어야한다.
각 배아를 정렬하여 핵, 축축및 눈이 선을 형성하고 면도날을 사용하여 이 선과 평행하게 아가로즈를 다듬습니다. 다음으로, 진동 챔버를 얼음 냉간 슬라이스 버퍼로 채우고, 블레이드가 오큘러모터 핵 및 눈과 평행할 수 있도록 첫 번째 배아를 진동 단계에 초접착제로 한다. 초접착제가 건조하면 진동단계를 잠수하여 배아가 블레이드에서 멀어지도록 하고 새로운 진동블레이드를 사용하여 400-450 마이크로미터 슬라이스를 얻습니다.
멸균 전달 파이펫을 사용하여 각 슬라이스를 차가운 슬라이스 버퍼로 옮기고, 형광 해부 현미경을 사용하여 오큘로모터 핵과 눈을 포함하는 슬라이스를 선택한다. 멸균 전달 파이펫을 사용하여, 슬라이스를 셀 배양 인서트에 잘 1.5 밀리리터의 배양 배지를 함유한 6웰 플레이트에 옮기고, 플레이트를 섭씨 37도 인큐베이터에 넣습니다. 진동 단계에서 잔류 아가로즈를 제거하고 다음 배아를 무대에 초접착제로 제거하고 모든 배아가 절제되고 도금될 때까지 조각을 계속 수집합니다.
그런 다음 적절한 용매로 희석된 관심있는 억제제 또는 재조합 분자의 적절한 농도를 각각의 우물의 배지에 첨가한다. 용량 응답 곡선을 만듭니다. 최대 72시간 동안 위상 대비 및 형광 현미경 검사법에 따라 30분마다 슬라이스를 이미지합니다.
자궁 발달에서 정상 동안, 첫 번째 녹색 형광 단백질 양성 oculomotor 축축작은 배아 일 11.5에 의해 궤도에 도달하여 최종 표적으로 분기하기 전에, 이 대표적인 슬라이스 문화에서 관찰된 바와 같이. 조각이 제대로 방향이 아닌 경우 해석할 수 없기 때문에 진동 단계의 슬라이스 방향은 매우 중요합니다. 예를 들어, 배아가 옆으로 기울어지면, 슬라이스 내에서 하나의 오큘로모터 핵만 관찰될 것이다.
임베디드 배아가 뒤쪽으로 너무 멀리 기울어지면, 눈은 슬라이스 안에 나타나지 않으며, 대신 상두부와 뒤뇌 또는 척수를 포함할 수 있다. 또한 배양막에 슬라이스를 배치하는 동안 조직이 접히지 않도록주의하는 것이 중요합니다. 유기 용매의 억제제 및 성장 인자를 용해 할 때주의하십시오.
예를 들어, 본 실험에서, 슬라이스는 매체에 에탄올을 첨가한 후에 죽었다. 모든 것을 얼음 위에 보관하고 배아를 추출하고 배양기에서 슬라이스를 배치하는 시간을 최소화해야 합니다. 이 기술을 사용하여 안구 모터 시스템에서 작업시 추가 축하 유도 메커니즘을 식별하기 시작했습니다.
면도날로 작업할 때주의해야 하며 일부 억제제는 위험할 수 있으며 안전 프로필에 따라 신중하게 처리해야 합니다.
