Este protocolo nos permite identificar vias de orientação de axônio ativas no nervo oculomotor e avaliar seus papéis em diferentes pontos ao longo da trajetória nervosa em tempo real. Essa técnica preserva os ambientes locais através dos quais os axônios viajam e seus alvos finais. Os axônios em crescimento não são cortados, por isso o crescimento inicial do axônio, em vez de regeneração, pode ser avaliado.
Este método fornece insights sobre a orientação do axônio no sistema motor ocular, mas poderia ser adaptado ao estudo da orientação do axônio de outros nervos. Essa técnica requer prática para dominar, e trabalhar rapidamente é extremamente importante. Ao tentar pela primeira vez, use apenas alguns embriões, em vez de uma ninhada inteira.
Antes de iniciar o procedimento, confirme pela primeira vez a gravidez por ultrassom no dia embrionário 10,5 a partir de um acasalamento cronometrado. Colher os embriões, pulverizar o abdômen do camundongo grávida com 70% de etanol e usar uma tesoura para abrir a cavidade abdominal para extrair o útero. Lave o útero em uma placa de Petri de HBSS gelado antes de colocar o órgão em uma segunda placa de Petri de HBSS fresco gelado.
Sob um escopo dissecando, remova os embriões do chifre uterino e seus sacos amnióticos individuais, colocando cada embrião na parte inferior da tampa de uma placa de 12 poços, no gelo, à medida que são colhidos. Use papel filtro para remover qualquer líquido ao redor de cada embrião, sem tocar nos embriões em si, e submergir os embriões em agarose de fusão líquida de 4%. Coloque a tampa da placa no gelo para solidificar a agarose.
Quando a agarose tiver endurecido, vire os embriões e cubra o outro lado de cada amostra com agarose adicional. Quando o segundo volume de agarose se solidificar, use um microscópio dissecando fluorescência para aparar a agarose em torno de cada embrião para que cada embrião seja orientado adequadamente no estágio vibratome. Os núcleos oculomotores e os primeiros crescimentos do axônio devem ser fluorescentes.
Alinhe cada embrião para que o núcleo, superando axônios, e os olhos formem uma linha, e use uma lâmina de barbear para aparar a agarose paralelamente a esta linha. Em seguida, encha a câmara de vibratome com tampão de fatia gelada, e supercole o primeiro embrião ao estágio vibratome para que a lâmina seja paralela com o núcleo e os olhos oculomotores. Quando a supercola estiver seca, submerse o estágio do vibratome para que o embrião seja orientado para longe da lâmina, e use uma nova lâmina de vibratome para obter fatias de 400 a 450 micrômetros.
Use uma pipeta de transferência estéril para transferir cada fatia em tampão de corte frio à medida que for adquirida, e use o microscópio de dissecação de fluorescência para selecionar a fatia contendo os núcleos e olhos oculomotores. Usando uma pipeta de transferência estéril, transfira a fatia para uma inserção de cultura celular em uma placa de seis poços contendo 1,5 mililitros de cultura média por poço, e coloque a placa em uma incubadora Celsius de 37 graus. Remova a ágarose residual do estágio vibratome, e supercole o próximo embrião no palco, continuando a coletar fatias até que todos os embriões tenham sido seccionados e banhados.
Em seguida, adicione a concentração adequada do inibidor ou molécula recombinante de interesse, diluída em um solvente apropriado, ao meio de cada poço. Crie uma curva de dose-resposta. Imagem as fatias a cada 30 minutos por contraste de fase e microscopia de fluorescência por até 72 horas.
Durante o desenvolvimento normal no útero, os primeiros axônios oculomotores fluorescentes verdes positivos chegam à órbita pelo dia 11,5 antes de se ramificarem para seus alvos finais, como observado nesta cultura representativa de fatias. A orientação da fatia no estágio vibratome é crucial, pois as fatias não são interpretáveis se não forem orientadas corretamente. Por exemplo, se o embrião for inclinado para o lado, apenas um núcleo oculomotor será observado dentro da fatia.
Se o embrião incorporado for inclinado muito para suas costas, os olhos não estarão presentes dentro da fatia, e em vez disso, o membro superior e o cérebro traseiro ou medula espinhal podem ser incluídos. Também é importante ter cuidado para que durante a colocação da fatia na membrana de cultura, o tecido não fique dobrado. Tome cuidado ao dissolver os inibidores e fatores de crescimento em solventes orgânicos.
Por exemplo, neste experimento, a fatia morreu após a adição de etanol ao meio. Lembre-se de manter tudo no gelo e minimizar o tempo entre a extração dos embriões e colocar as fatias na incubadora. Usando essa técnica, começamos a identificar mecanismos adicionais de orientação de axônio no trabalho no sistema motor ocular.
Lembre-se de ter cuidado ao trabalhar com lâminas de barbear e que alguns inibidores podem ser perigosos e devem ser manuseados cuidadosamente de acordo com seus perfis de segurança.
