يسمح لنا هذا البروتوكول بتحديد مسارات التوجيه المحوري النشطة في العصب المُنمُرّح وتقييم أدوارها في نقاط مختلفة على طول المسار العصبي في الوقت الحقيقي. هذه التقنية تحافظ على البيئات المحلية التي من خلالها محاور السفر وأهدافها النهائية. لا يتم قطع المحاور المتنامية ، لذلك يمكن تقييم محور عصبي أولي ، بدلاً من التجديد.
توفر هذه الطريقة رؤى في توجيه محور عصبي في نظام المحركات العينية ولكن يمكن تكييفها لدراسة توجيه محور عصبي للأعصاب الأخرى. هذه التقنية يأخذ الممارسة لإتقان، والعمل بسرعة هو في غاية الأهمية. عند محاولة ذلك لأول مرة، واستخدام عدد قليل من الأجنة، بدلا من القمامة كاملة.
قبل البدء في الإجراء، تأكد أولاً من الحمل بالموجات فوق الصوتية في اليوم الجنيني 10.5 من التزاوج في الوقت المناسب. احصد الأجنة، رش بطن الفأرة الحامل بنسبة 70٪ الإيثانول، واستخدم المقص لفتح تجويف البطن لاستخراج الرحم. اغسل الرحم في طبق بيتري من HBSS الباردة الجليد قبل وضع الجهاز في طبق بيتري الثاني من الجليد الطازج HBSS.
تحت نطاق تشريح، وإزالة الأجنة من القرن الرحم والسائل السلوي الفردية، ووضع كل جنين على الجانب السفلي من غطاء لوحة 12 جيدا، على الجليد، كما يتم حصادها. استخدام ورقة مرشح لإزالة أي سائل المحيطة كل جنين، دون لمس الأجنة نفسها، وغمر الأجنة في سائل 4٪ ذوبان أغروز منخفضة. ضع غطاء اللوحة على الجليد لترسيخ الأغاروز.
عندما يكون agarose قد تصلب، الوجه على الأجنة وتغطية الجانب الآخر من كل عينة مع agarose إضافية. عندما يتوطد الحجم الثاني من agarose، استخدم المجهر تشريح الفلوريس لتقليم agarose حول كل جنين بحيث سيتم توجيه كل جنين بشكل صحيح على مرحلة هزاز. وينبغي أن تكون نوى oculomotor ومحور عصبي في وقت مبكر من الفلورسنت.
محاذاة كل جنين بحيث نواة، محاور متفرعة، والعين تشكل خطا، واستخدام شفرة حلاقة لتقليم agarose موازية لهذا الخط. بعد ذلك ، املأ غرفة الاهتزاز مع عازلة شريحة الجليد الباردة ، و superglue الجنين الأول إلى مرحلة الاهتزاز بحيث يكون النصل موازيًا مع نواة العيون والعيون oculomotor. عندما يكون الغمرة الفائقة جافة، غمر مرحلة الاهتزاز بحيث يتم توجيه الجنين في مواجهة بعيدا عن شفرة، واستخدام شفرة هزلية جديدة للحصول على شرائح 400-450 ميكرومتر.
استخدام ماصة نقل العقيمة لنقل كل شريحة في المخزن المؤقت تشريح الباردة كما هو المكتسبة، واستخدام المجهر تشريح الفلوريستين لتحديد شريحة تحتوي على نوى oculomotor والعينين. باستخدام ماصة نقل معقم، نقل شريحة على إدراج ثقافة الخلية في لوحة ستة بئر تحتوي على 1.5 ملليلتر من المتوسط ثقافة في البئر، ووضع لوحة في حاضنة 37 درجة مئوية. إزالة agarose المتبقية من مرحلة هزاز، وsuperglue الجنين المقبل على خشبة المسرح، والاستمرار في جمع شرائح حتى تم تقسيم جميع الأجنة ومطلية.
ثم إضافة التركيز المناسب من المانع أو جزيء المؤتلف من الفائدة، مخففة في المذيب المناسب، إلى الوسط من كل بئر. إنشاء منحنى استجابة الجرعة. صورة الشرائح كل 30 دقيقة على النقيض من المرحلة والمجهر الفلوريسنس لمدة تصل إلى 72 ساعة.
خلال فترة التطور الطبيعي في الرحم، تصل أول محاور محورية أوكولوموتوكرية إيجابية بالبروتين الأخضر إلى المدار في اليوم الجنيني 11.5 قبل أن تتفرع إلى أهدافها النهائية، كما لوحظ في ثقافة الشريحة التمثيلية هذه. اتجاه الشريحة على مرحلة الاهتزاز أمر بالغ الأهمية ، حيث أن الشرائح غير قابلة للتفسير إذا لم تكن موجهة بشكل صحيح. على سبيل المثال، إذا كان الجنين يميل إلى جانبه، سيتم ملاحظة نواة واحدة فقط من الoculomotor داخل الشريحة.
إذا كان الجنين جزءا لا يتجزأ من إمالة بعيدا جدا نحو ظهره، والعينين لن تكون موجودة داخل شريحة، وبدلا من ذلك قد يتم تضمين الطرف العلوي و hindbrain أو الحبل الشوكي. من المهم أيضا أن تأخذ الرعاية أنه خلال وضع شريحة على غشاء الثقافة، أن الأنسجة لا تصبح مطوية. الحرص عند حل المثبطات وعوامل النمو في المذيبات العضوية.
على سبيل المثال، في هذه التجربة، توفي شريحة بعد إضافة الإيثانول إلى الوسط. تذكر أن تبقي كل شيء على الجليد وتقليل الوقت بين استخراج الأجنة ووضع شرائح في الحاضنة. باستخدام هذه التقنية، بدأنا في تحديد آليات إضافية لتوجيه محور عصبي في العمل في نظام المحركات العينية.
تذكر أن الحذر عند العمل مع شفرات الحلاقة وأن بعض مثبطات قد تكون خطرة وينبغي التعامل معها بعناية وفقا لمحات السلامة الخاصة بهم.
