De-lib-er-ating מוצר CAR T Cell עם יכולת תפקודית כי תחריט, להתרבות ויש לו פעילות cit-el-uric בעקבות עירוי הוא מרכיב מרכזי של אימונותרפיה מאמצת יעילה. לדוגמה, בגידולים מוצקים, תאי CAR T הם יכולים לחדור גידולים מוצקים והם מקבלים גירוי אנטיגן אופטימלי;עם זאת, ההחרטה הכוללת שלהם ואת התפשטות הוא מכשולים באנשים. היתרון העיקרי של גישה זו היא כי זה יכול לשמור על איכות תאי CAR T או מצב ההבחנה של תאי CAR T מבלי ליצור תאי T מובחנים סופניים או מותשים, אשר היה פחת יכולת התפשטות או תפקוד יעיל ירוד בעקבות עירוי.
טכניקה זו יכולה להיות קשה כי תאי T רגישים מאוד לריכוז התאים שלהם או לאזור הפנים של כלי הדם שבהם הם מתורבתים. כמו גם הצרכים המטבוליים שלהם. בעיקרו של דבר תאי T צריכים להישמר מאושרים לאורך כל התהליך, אחרת הם לא יגדלו.
כדי להתחיל בהליך זה, להגדיר 6 גם מנות תרבות. הפעל תאי T אנושיים ראשוניים טריים או שמורים בהקפאה על-ידי ערבובם עם חרוזים מגנטיים נגד CD3 CD28, ביחס של שלושה חרוזים לתא T בארות של מנות התרבות. תרבות תאי T ב X-Vivo 15 בינוני בתוספת סרום AB אנושי רגיל, L-גלוטמין, he-pees ו IL2.
הפעל את תאי T בריכוז של מיליון תאי T למיליליטר במהלך ההתפשטות. ולתרבת אותם ב 37 מעלות צלזיוס עם 20% חמצן, 5% פחמן דו חמצני ו 95% לחות. לאחר גירוי לילה, להוסיף lentiviral על טבעי לתאי T מופעל.
לחשב את נפח supernatants הדרושים כדי להשיג ריבוי של זיהום בין שלוש לחמש. המשך culturing התאים באמצעות אותם תנאים. ביום השלישי, לאסוף aliquot נציג של התאים של שימור קריו.
לפני שימור קריו, להסיר את חרוזים מגנטיים על ידי צינורות בעדינות והפרדה מגנטית. הכן את אמצעי ההקפאה, המכיל PBS עם 0.5%DMSO. ולאחסן אותו בארבע מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש.
לאחר מכן, צנטריפוגה תאי T ב 300 פעמים G במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי והוסף חמישה מיליליטר של PBS. צנטריפוגה התאים שוב ב 300 פעמים G במשך חמש דקות ולהשליך את PBS.
אנחנו להשעות את pellant במיליליטר אחד של מדיום קריו שימור קר. להקפיא את תאי T במיכל הקפאה מקורר. ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.
לאחר מכן, להעביר את התאים הקפואים לחנקן נוזלי. לשטוף את שאר תאי T פעם בחמישה מיליליטר של PBS כדי לחסל כל וקטור שיורית. צנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך חמש דקות.
לאחר מכן, decant PBS ולהשעות מחדש את פלנט התא במדיום תרבות תא T בריכוז של 500, 000 תאים למיליליטר. לפצל את תאי T לשתי תרבויות שתוכננו 45 ותשע. לספור את תאי T על ידי ציטומטריה זרימה באמצעות חרוזים ספירה ונוגדנים חד שבטיים ל CD4 ו- CD8 אנושי.
כמו גם צבע הכדאיות. הזינו מחדש את התרבויות כל יומיים כדי לשמור עליהן בריכוז של 500,000 תאים למיליליטר. ביום החמישי, לספור קריו לשמר את היום חמש תרבויות כפי שתואר קודם לכן.
ביום השביעי, לשטוף 500, 000 תאים ב PBS. ולהשעות אותם מחדש ב-100 מיקרוליטרים של מאגר מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות. לאחר מכן, לזהות ביטוי חלבון משטח CAR על ידי אימונו מכתים עם אנטי CAR 19 idio-סוג פלואורסצנטי על ידי ציטומטריה זרימה.
ביום התשיעי ספירה והקפאה לשמר את היום תשע תרבויות כפי שתואר קודם לכן. במחקר זה נמדדים הפונקציה והיעילות של תאי CAR T שנקטפים במרווחים משתנים לאורך תרבות X-Vivo. באמצעות השיטות המתוארות בסרטון זה, תאי T מגורים ומורחבים במשך שלושה או תשעה ימים.
פרופיל בידול התאים כפי שצוין על ידי אסטרטגיית gating המוצגת כאן, מנותח על ידי מדידת השפע של גליקופרוטאינים ברורים לידי ביטוי על פני התא. שינוי הדרגתי לכיוון ההתברמות של האפקטים נראה לאורך זמן במהלך תרבות X-Vivo. פונקציית המחולל ויכולת השגשוג של תאי CAR T בתגובה לאנטיגן מוערכת לאחר מכן.
תאים המורחבים פחות עדיפים מבחינה תפקודית על אלה המתורגם בהרחבה לאורך זמן ארוך יותר. במודל עכבר קסנוגרפט אנושי של כל העוצמה של תאי CAR T שנקטפו בתקופות זמן שונות מושווה. תאי תשעת הימים מראים תגובה אנטי לוקמית תלוית מינון עם תגובה מלאה בשווי מינון גבוה של שלושה מיליון;ואובדן יעילות עבור המינון הנמוך של 500, 000.
עם זאת, היום שלושה תאים הראו שליטה מתמדת גידול במינונים גבוהים ונמוכים. תגובה זו קשורה לספירה המוחלטת של CAR-T 19 בדם ההיקפי של עכברים. בסך הכל, תוצאות אלה מספקות ראיות כי תאי T CAR שנקטפו קודם לכן, ביצועים טובים יותר אלה שנקטפו מאוחר יותר.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע בדיקות פונקציה נוספות כגון בדיקות סוסון ים כדי למדוד את המאפיינים המטבוליים שלהם כגון צריכת חמצן או קיבולת ספיר-it-ed. מספר סבבים של גירוי מחדש יכולים להתבצע גם כדי לספק תובנה על ההתמדה שלהם וההתמדה של תאי CAR T. באמצעות עבודה זו כבסיס אנו וחוקרים אחרים עוסקים במחקרים כדי לקצר את תהליך התרבות עוד יותר.
זה יכול גם להיות מורחב בעיצוב גישות הליבה עבור אנטיגנים סרטן אחרים. טיפול תמיד צריך להילקח כאשר אתה עובד עם lentivirus. אבל גם כאשר lentivirus מתוכנן להיות שכפול פסול.
