De-lib-er-ating un producto CAR T Cell con competencia funcional que ingrafota, prolifera y tiene actividad cit-el-uric después de la perfusión es un componente clave de una inmunoterapia adoptiva eficaz. Por ejemplo, en tumores sólidos, células T CAR pueden penetrar tumores sólidos y reciben una estimulación óptima del antígeno;sin embargo, su injerto general y la proliferación se ve obstaculizada en las personas. El principal beneficio de este enfoque es que puede conservar la calidad de las células T CAR o el estado de diferenciación de las células T DEL CAR sin generar células T diferenciadas o agotadas terminalmente, que habrían disminuido la capacidad proliferativa o una función efectiva deficiente después de la perfusión.
Esta técnica puede ser difícil porque las células T son muy sensibles a su concentración celular o a la superficie de los vasos en los que se cultivan. Así como sus necesidades metabólicas. Esencialmente las células T necesitan ser mantenidas felices durante todo el proceso, de lo contrario no crecerán.
Para comenzar este procedimiento, establecer platos de cultura de 6 pozos. Activar células T humanas primarias frescas o crio-preservadas mezclándolas con cuentas magnéticas anti-CD3 CD28, a una proporción de tres cuentas por célula T en los pozos de los platos de cultivo. Cultivo de las células T en X-Vivo 15 medio complementado con suero HUMANO normal AB, L-glutamina, he-pees e IL2.
Activar las células T a una concentración de un millón de células T por mililitro durante la expansión. Y cultivarlos a 37 grados Celsius con 20%oxígeno, 5% dióxido de carbono y 95% de humedad. Después de la estimulación durante la noche, añadir sobrenadantes lentivirales a las células T activadas.
Calcular el volumen de sobrenadantes necesarios para lograr una multiplicidad de infección entre tres y cinco. Continúe cultivando las células usando las mismas condiciones. En el tercer día, recoger una alícuota representativa de las células de la crio-preservación.
Antes de la criopreservación, retire las perlas magnéticas pipeteando suavemente y la separación magnética. Prepare el medio de congelación, que contiene PBS con 0,5%DMSO. Y guárdelo a cuatro grados centígrados hasta que esté listo para usar.
A continuación, centrifugar las células T a 300 veces G durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y agregue cinco mililitros de PBS. Centrifugar las células de nuevo a 300 veces G durante cinco minutos y desechar el PBS.
Suspendimos el pellant en un mililitro de medio crio-preservación en frío. Congele las células T en un recipiente de congelación refrigerado. Y almacenar a menos 80 grados Celsius durante 48 horas.
Después de esto, transfiera las células congeladas al nitrógeno líquido. Lavar el resto de las células T una vez en cinco mililitros de PBS para eliminar cualquier vector residual. Centrifugar a 300 veces G durante cinco minutos.
Luego, decantar el PBS y volver a suspender el pellant celular en el medio de cultivo de células T a una concentración de 500.000 células por mililitro. Divida las células T en dos cultivos diseñados 45 y nueve. Cuente las células T por citometría de flujo utilizando cuentas y anticuerpos monoclonales para CD4 y CD8 humanos.
Así como un tinte de viabilidad. Realimentar los cultivos cada dos días para mantenerlos a una concentración de 500.000 células por mililitro. En el quinto día, cuente y crio-preservar el día cinco culturas como se describió anteriormente.
El día siete, lave 500.000 células en PBS. Y re-suspenderlos en 100 microlitros de fluorescencia activado buffer de clasificación de células. A continuación, detecte la expresión de la proteína superficial CAR mediante inmunomanteración con un anti-CAR 19 conjugado fluorescente por citometría de flujo.
En el día nueve cuenta y crio-preservar el día nueve culturas como se describió anteriormente. En este estudio se mide la función y eficacia de las células T CAR que se cosechan a intervalos variables a lo largo del cultivo de X-Vivo. Usando los métodos descritos en este video, las células T se estimulan y expanden durante tres o nueve días.
El perfil de diferenciación de células como se indica en la estrategia de gating que se muestra aquí, se analiza midiendo la abundancia de glicoproteínas distintas expresadas en la superficie celular. Un cambio progresivo hacia la diferenciación del efector se observa con el tiempo durante la cultura X-Vivo. A continuación, se evalúa la función del efector y la capacidad proliferativa de las células T CAR en respuesta al antígeno.
Las celdas que se expanden menos son funcionalmente superiores a las que se cultivan ampliamente durante una duración más larga. En un modelo de ratón de xenoinjerto humano de TODO se compara la potencia de las células T CAR cosechadas en diferentes períodos de tiempo. Las células de nueve días muestran una respuesta antihím de dosis dependiente con una respuesta completa que vale una dosis alta de tres millones;y una pérdida de eficacia para la dosis baja de 500.000.
Sin embargo, las tres células del día mostraron un control persistente del tumor en dosis altas y bajas. Esta respuesta se asocia con el recuento absoluto de CAR-T 19 en la sangre periférica de ratones. En general, estos resultados proporcionan evidencia de que las células T del CAR cosechadas antes, superan a las cosechadas más tarde.
Después de este procedimiento, se pueden realizar ensayos de función adicionales como el ensayo de caballitos de mar para medir sus propiedades metabólicas, como el consumo de oxígeno o la capacidad de spir-it-ed. También se pueden realizar varias rondas de reestimulación para proporcionar información sobre su diferenciación y persistencia de las células T del CAR. Usando este trabajo como fundación, nosotros y otros investigadores estamos involucrados en estudios para abreviar aún más el proceso de cultivo.
También se puede extender en el diseño de enfoques básicos para otros antígenos cancerosos. Siempre hay que tener cuidado cuando trabaje con lentivirus. Pero incluso cuando el lentivirus está diseñado para ser incompetente para la replicación.
