De-lib-er-engraft fonksiyonel yetkinlik ile bir CAR T Hücre ürün ating, çoğalır ve infüzyon sonrası sit-el-ürik aktiviteye sahip etkili bir benimseyen immünoterapi önemli bir bileşenidir. Örneğin, katı tümörlerde, CAR T hücreleri katı tümörlere nüfuz edebilir ve optimal antijen stimülasyonları alırlar;ancak, genel engraftment ve proliferasyon insanlarda engellenir. Bu yaklaşımın en önemli yararı, car T hücrelerinin kalitesini veya CAR T hücrelerinin farklılaşma durumunu ölümcül olarak farklılaşmış veya tükenmiş T hücreleri üretmeden koruyabilmesidir, bu da infüzyon sonrasında proliferatif kapasiteyi veya zayıf etkili işlevi azaltmış olacaktır.
T hücreleri hücre konsantrasyonuna veya kültürlendikleri damarların yüzey alanına çok duyarlı olduğu için bu teknik zor olabilir. Metabolik ihtiyaçları kadar. Esasen T hücreleri süreç boyunca mutlu tutulması gerekir, aksi takdirde büyümek olmaz.
Bu prosedüre başlamak için, 6-iyi kültür yemekleri yola. Kültür yemeklerinin kuyularında T hücresi başına üç boncuk oranında, anti-CD3 CD28 manyetik boncuklar ile karıştırarak taze veya kriyo korunmuş birincil insan T hücreleri etkinleştirin. Kültür X-Vivo 15 orta normal insan AB serum, L-glutamin, he-pees ve IL2 ile birlikte T hücreleri.
Genişleme sırasında mililitre başına bir milyon T hücre konsantrasyonu t hücreleri etkinleştirin. Ve onları %20 oksijen, %5 karbondioksit ve %95 nem oranıyla 37 derecede kültürleyin. Gece stimülasyon sonra, aktif T hücrelerine lentiviral supernatants ekleyin.
Üç ile beş arasında çok sayıda enfeksiyon elde etmek için gerekli supernatants hacmini hesaplayın. Aynı koşulları kullanarak hücreleri culturing devam edin. Üçüncü gün, kriyo-koruma hücrelerinin temsili bir aliquot toplamak.
Kriyo-koruma dan önce, manyetik boncukları yavaşça pipetleme ve manyetik ayırma ile çıkarın. %0,5 DMSO ile PBS içeren dondurma ortamını hazırlayın. Ve kullanıma hazır olana kadar dört santigrat derecede saklayın.
Daha sonra, T hücrelerini 5 dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj edin. Supernatant atın ve PBS beş mililitre ekleyin. Hücreleri tekrar 300 kez G'de beş dakika santrifüj edin ve PBS'yi atın.
Pellantı bir mililitre soğuk kriyo koruma aracıyla askıya alıyoruz. Soğutulmuş bir dondurucu kapta T hücrelerini dondurun. Ve eksi 80 derecede 48 saat saklayın.
Bundan sonra, sıvı nitrojen dondurulmuş hücreleri aktarın. Kalan vektörü ortadan kaldırmak için t hücrelerinin geri kalanını beş mililitre PBS'de bir kez yıkayın. 5 dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj.
Daha sonra, PBS decant ve mililitre başına 500, 000 hücre konsantrasyonu t hücre kültürü orta hücre pellant yeniden askıya. T hücrelerini 45 ve 9'da tasarlanmış iki kültüre ayırın. İnsan CD4 ve CD8 sayma boncukları ve monoklonal antikorları kullanarak t hücrelerini akış sitometrisi ile sayın.
Canlılık boyası gibi. Kültürleri her gün besleyin ve mililitrede 500,000 hücrenin konsantrasyonunda koruyun. Beşinci günde, daha önce açıklandığı gibi beş kültürün gününü sayve kısık bir şekilde koru.
Yedinci günde, PBS'de 500.000 hücreyı yıkayın. Ve onları 100 mikrolitre floresan aktif hücre sıralama tamponuyla tekrar askıya alıyor. Daha sonra, akış sitometrisi tarafından floresan caiz anti-CAR 19 idio tipi ile immüno boyama ile CAR yüzey protein ekspresyonunu saplayın.
Dokuzuncu günde, daha önce açıklandığı gibi dokuzuncu günü saymak ve kriyo-korumak. Bu çalışmada X-Vivo kültürü boyunca çeşitli aralıklarla hasat edilen CAR T hücrelerinin işlevi ve etkinliği ölçüldü. Bu videoda açıklanan yöntemler kullanılarak, T hücreleri uyarılır ve üç veya dokuz gün boyunca genişletilir.
Burada gösterilen gating stratejisinde belirtildiği gibi hücre farklılaşma profili, hücre yüzeyinde ifade edilen farklı glikoproteinlerin bolluğu ölçülerek analiz edilir. X-Vivo kültürü sırasında zaman içinde efektör farklılaşmaya doğru ilerleyici bir kayma görülür. Daha sonra antijene yanıt olarak CAR T hücrelerinin efektör fonksiyonu ve proliferatif kapasitesi değerlendirilir.
Daha az genişlemiş hücreler işlevsel olarak daha uzun bir süre boyunca yaygın olarak kültürlenmiş hücrelerden daha üstündür. Farklı zaman dilimlerinde hasat edilen CAR T hücrelerinin tüm gücü bir insan ksenogreft fare modelinde karşılaştırılır. Dokuz günlük hücreler, doza bağımlı anti-lukemik yanıtı, üç milyon luk yüksek dozdeğerinde tam bir yanıt ve 500,000'lik düşük doziçin etkinlik kaybı gösterir.
Ancak, gün üç hücre hem yüksek hem de düşük dozlarda kalıcı tümör kontrolü gösterdi. Bu yanıt farelerin periferik kan CAR-T 19 mutlak sayısı ile ilişkilidir. Genel olarak, bu sonuçlar CAR T hücrelerinin daha önce hasat, daha sonra hasat daha iyi performans kanıt sağlar.
Bu prosedürü takiben, oksijen tüketimi veya spir-it-ed kapasitesi gibi metabolik özelliklerini ölçmek için denizatı tahlil gibi ek fonksiyon denemeleri yapılabilir. CAR T hücrelerinin farklılaşması ve kalıcılığı hakkında bilgi sağlamak için birkaç tur yeniden stimülasyon da yapılabilir. Bu çalışmayı bir temel olarak kullanarak biz ve diğer araştırmacılar kültür sürecini daha da kısaltmak için çalışmalar yapıyoruz.
Aynı zamanda diğer kanser antijenleri için çekirdek yaklaşımlar tasarım uzatılabilir. Eğer lentivirus ile çalışırken bakım her zaman alınması gerekir. Ama lentivirus çoğaltma yetersiz olacak şekilde tasarlanmış olsa bile.
