Де-lib-er-ating продукт CAR T Cell с функциональной компетентностью, которая размножается, размножается и имеет цит-эль-уриховую активность после инфузии, является ключевым компонентом эффективной приемной иммунотерапии. Например, при твердых опухолях Т-клеток ЦАР они могут проникать в твердые опухоли и получать оптимальную стимуляцию антигена; однако, их общая притяжение и пролиферация затруднены у людей. Основным преимуществом этого подхода является то, что он может сохранить качество Т-клеток ЦАР или состояние дифференциации Т-клеток ЦАР без генерации неизлечимо дифференцированных или исчерпанных Т-клеток, что уменьшило бы пролиферативную способность или плохую эффективную функцию после вливания.
Этот метод может быть трудным, потому что Т-клетки очень чувствительны к их концентрации клеток или площади поверхности сосудов, что их культурные дюйма А также их метаболические потребности. По существу Т-клетки должны быть счастливы на протяжении всего процесса, в противном случае они не будут расти.
Для начала этой процедуры, изготовить 6-ну культуры блюда. Активируйте свежие или крио-сохраненные первичные Т-клетки человека, смешивая их с магнитными бусинами anti-CD3 CD28, в соотношении трех бусин на Т-клетку в колодцах культурных блюд. Культура Т-клеток в X-Vivo 15 среды дополняется нормальной сыворотки AB человека, L-глутамин, он-пи и IL2.
Активируйте Т-клетки с концентрацией в один миллион Т-клеток на миллилитр во время расширения. И культуры их при 37 градусов по Цельсию с 20%кислорода, 5%углекислого газа и 95%влажности. После ночной стимуляции добавьте лентивирусные супернатанты в активированные Т-клетки.
Рассчитайте объем супернатантов, необходимых для достижения множественности инфекции от трех до пяти. Продолжайте культивирование клеток, используя те же условия. На третий день соберите репрезентативную алициту клеток криосохранения.
Перед криосохранения, удалить магнитные бусы, мягко пипетки и магнитного разделения. Подготовка замораживания среды, которая содержит PBS с 0,5%DMSO. И хранить его при четырех градусах по Цельсию до готовности к использованию.
Далее центрифуга Т-клеток в 300 раз G в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и добавьте пять миллилитров PBS. Центрифуга клетки снова на 300 раз G в течение пяти минут и отказаться от PBS.
Мы приостанавливаем пеллант в одном миллилитре холодного крио-сохранения среды. Заморозить Т-клетки в охлажденном замораживании контейнера. И хранить при температуре минус 80 градусов по Цельсию в течение 48 часов.
После этого перенесите замороженные клетки в жидкий азот. Вымойте остальные Т-клетки один раз в пять миллилитров PBS, чтобы устранить любой остаточный вектор. Центрифуга при 300 раз G в течение пяти минут.
Затем, decant PBS и повторно приостановить ячейки pellant в среде культуры Т-клеток в концентрации 500000 клеток на миллилитр. Разделите Т-клетки на две культуры, разработанные 45 и 9. Подсчитайте Т-клетки по цитометрии потока, используя подсчет бисера и моноклональных антител к человеческим CD4 и CD8.
А также краситель жизнеспособности. Перекармливайте культуры через день, чтобы поддерживать их в концентрации 500 000 клеток на миллилитр. На пятый день, рассчитывать и крио-сохранить день пять культур, как описано ранее.
На седьмой день вымойте 500 000 клеток в PBS. И повторно приостановить их в 100 микролитров флуоресценции активированного буфера сортировки клеток. Затем обнаружите экспрессию поверхностного белка CAR путем иммуноокрашивания флуоресцентно конъюгированных анти-CAR 19 идиотского типа по цитометрии потока.
На девятый день считать и крио-сохранить день девять культур, как описано ранее. В этом исследовании измеряются функции и эффективность Т-клеток ЦАР, которые собирают с различными интервалами по всей культуре X-Vivo. Используя методы, описанные в этом видео, Т-клетки стимулируются и расширяется в течение трех или девяти дней.
Профиль дифференциации клеток, как указано в стратегии gating показано здесь, анализируется путем измерения обилия различных гликопротеинов, выраженных на поверхности клетки. Прогрессивный сдвиг в сторону дифференциации эффектора наблюдается с течением времени во время культуры X-Vivo. Затем оценивается функция эффектора и пролиферативная способность Т-клеток ЦАР в ответ на антиген.
Клетки, которые расширены меньше функционально превосходят те, широко культурных в течение более длительного времени. В человеческой модели ксенотрансплантата мыши ВСЕХ сравнивается потенция Т-клеток CAR, собранных в разные периоды времени. Девятидневные клетки показывают дозозависимый анти-люкемический ответ с полным ответом стоит высокую дозу в три миллиона; и потерю эффективности для низкой дозы 500 000.
Тем не менее, в день три клетки показали стойкий контроль опухоли в высоких и низких дозах. Этот ответ связан с абсолютным подсчетом CAR-T 19 в периферической крови мышей. В целом, эти результаты свидетельствуют о том, что ЦАР Т-клеток, собранных ранее, превосходят тех, собранных позже.
После этой процедуры, дополнительные анализы функции, такие как анализ морского конька могут быть выполнены для измерения их метаболических свойств, таких как потребление кислорода или spir-it-ed потенциала. Несколько раундов рестимуляции также могут быть выполнены, чтобы дать представление об их дифференциации и стойкости Т-клеток CAR. Используя эту работу в качестве основы, мы и другие исследователи занимаемся исследованиями по дальнейшему сокращению культурного процесса.
Он также может быть расширен в основных подходов дизайн для других антигенов рака. Уход всегда должны быть приняты, когда вы работаете с лентивирусом. Но даже тогда, когда лентивирус разработан, чтобы быть репликации некомпетентным.
