קשה להשתמש בשלב הזיהום המארח של T.cruzi בניסויים כי amastigote הוא טפיל תאי חובה. טכניקת הכת שלנו מאפשרת ל-amastigote לשכפל באופן זמני מחוץ לתא המארח, כדי שנוכל לבצע ניסויים ישירות בשלב זה הרלוונטי מבחינה קלינית של הטפיל. הדגמת ההליך תהיה יוקי Akutsu, טכנאי מהמכון שלנו.
לשמור על תרבות טפיל מארחת על פי הוראות כתב היד. כאשר הטפיל המבטא Cas9 מוכן להבחנה, לאסוף את העל-טבעי לתוך צינור חרוט, ולבדוק איכות מדגם תחת מיקרוסקופ. אם יש מספר משמעותי של מסטיגוטים חוץ תאיים, לבצע הליך לשחות החוצה כדי לבודד את טריפומסטיגוטים.
לסובב את התערובת של טריפומסטיגוטים וצברים במשך רבע שעה כמו 2, 100 פעמים G.Then להשליך את רוב העל טבעי, משאיר 0.5 כדי 1 מיליליטר של בינוני בצינור. מכסים באופן רופף את הצינור, ו דגירה את גלולה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה עד שעתיים, אשר יאפשר trypomastigotes פעיל לשחות מתוך גלולה. לאחר הדגירה, מעבירים את העל-טבעי עם הטריפומסטיגוטים לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר.
לסובב אותו, ולתלות מחדש את גלולה עם 5 מיליליטר של DMEM. מעבירים את הטפיל לבקבוק תרבות T-25, ומדגרים את הבקבוק ב-37 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% פחמן דו-חמצני באינקובטור לח. כ-95% מהטפילים יתבדלו לתוספים לאחר 24 שעות.
צנטריפוגה התרבות של מסטיגוטים חוץ תאיים במשך 15 דקות ב 2, 100 פעמים G, ולהשליך את העל טבעי. תן מחדש את גלולה עם מאגר אלקטרופולציה המכיל פתרון תוספת שסופקו צפיפות התא הסופי של אחד פעמים 10 לתאים 8 למיליליטר. Aliquot 100 microliters של טפילים resuspended לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 ליטר.
לאחר מכן הוסיפו 5 עד 10 מיקרוגרם של מדריך RNA, ומערבבים בעדינות על ידי צינורות. מעבירים את התערובת לתוספת אלקטרופורציה של שני מילימטרים, ומחילים דופק עם מכשיר האלקטרופולציה. לאחר מכן, מעבירים את תכולת הקובטה לבקבוק T-25, המכיל חמישה מיליליטר של מדיום LIT לפני המלחמה, משאירים את הכובע רופף, ומדירים את הבקבוק ב-37 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% פחמן דו-חמצני.
לפקח על צמיחת התא או על ידי המשך של culturing צירי או כמו מצבות תאיים לאחר זיהום התא המארח. אם ניטור צמיחת התא כמו amastigotes axenic, בעדינות לנער את הבקבוק כדי לעכל את הצברים חוץ תאיים לתוך הפתרון, ולערבב 20 microliters של התרבות עם מיקרוליטר אחד של פתרון propidium יודיד בצינור microcentrifuge. חשוב לא להשאיר את בקבוק התרבות מחוץ לאנקובטור למשך זמן רב מהנדרש מכיוון שהטמפרטורה היא אחד הגורמים המאפשרים התפשטות צירית של אמסטיגוטה.
יש למרוח את הדגימה על המוציטומטר, ולצפות בה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ואז לספור את מספר amastigotes קיימא כי אינם מוכתמים על ידי יודיד פרופידיום. כדי לפקח על הצמיחה של תאי נוקאאוט כמו מצבור תאי, זרע לארח 3T3 תאים בצלחת 12 באר עם DMEM.
יום אחד לאחר האלקטרופוזיה לאסוף את צובר הנוקאאוט על ידי צנטריפוגה, להשליך את supernatant, ו resuspend הטפילים עם שני מיליליטר של DMEM. הסר את המדיום מתרבות התאים המארחים והוסף את הצברים המתווים מחדש. הדגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני במשך יומיים, אשר יאפשר את הממסטיגוטים להקים זיהום.
לאחר יומיים, לשטוף את הצברים חוץ-תאיים מחוץ לתאים מארחים עם DMEM, ולהוסיף DMEM טרי. המשיכו את הדגירה במשך יומיים נוספים, ולאחר מכן דמיינו את הגרעינים של התאים המארחים ואת המחסות התאיות. הוכח כי T.Cruzi amastigotes מנוכה עם מדריך RNA נגד הגן החיוני TcCGM1 להראות פגם צמיחה משמעותי בהשוואה לקבוצת ביקורת.
בעת ניטור הצמיחה כמו מצבור תאיים, השבר של גרעיני המארח הקשורים T.Cruzi גרעיני הוא נמוך באופן משמעותי בקבוצת נוקאאוט TcCGM1 בהשוואה לשליטה. להיפך, transfection של מדריך RNA נגד אחד חלבוני מוט paraflagellar TcPAR1 אינו משפיע באופן משמעותי על צמיחת התאים לאחר ארבעה ימים של culturing צירי או לעכב את הצמיחה של מצבות תאיים. עם זאת, חמישה ימים לאחר ההדבקה, מספר טריפומסטיגוטים העולים מהתא המארח נמוך משמעותית בתרבות הנוקאאוט TcPAR1 בהשוואה לתרבות השליטה.
יתר על כן, טריפומסטיגוטים מובחנים בתוך התא המארח בקבוצת הביקורת נראו פעילים יותר מאלה בקבוצת הנוקאאוט. שיטה זו יכולה לשמש גם כדי ללמוד את ההשפעות של גנים אקסוגניים על הבמה amastigote במקום לשנות מדריך RNA לתוך Cas9-ביטוי amastigote, אתה יכול לשנות את הפלסמיד לתוך צבר מסוג בר להביע גן אקסוגני.
