É difícil usar o estágio de infecção hospedeira de T.cruzi em experimentos porque amastigote é um parasita intracelular obrigatório. Nossa técnica de cultivo permite que o amastigote se replique temporariamente fora da célula hospedeira, para que possamos realizar experimentos diretamente neste estágio clinicamente relevante do parasita. Demonstrando o procedimento será Yukie Akutsu, um técnico do nosso instituto.
Mantenha uma co-cultura de parasita hospedeiro de acordo com as instruções do manuscrito. Quando o parasita que expressa Cas9 estiver pronto para diferenciação, colete o sobrenante em um tubo cônico e verifique se há qualidade da amostra sob um microscópio. Se houver um número significativo de amastigotes extracelulares, realize um procedimento de natação para isolar os tripuladores.
Gire a mistura de tripuladores e amastigotes por quinze minutos como 2,100 vezes G.Em seguida, descarte a maior parte do supernatante, deixando de 0,5 a 1 mililitro de médio no tubo. Tampe o tubo livremente, e incubar a pelota a 37 graus Celsius por uma a duas horas, o que permitirá que os trypomastigotes ativos nadem para fora da pelota. Após a incubação, transfira o supernatante com os trypomastigotes para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.
Gire-o para baixo, e resuspense a pelota com 5 mililitros de DMEM. Transfira o parasita para um frasco de cultura T-25, e incubar o frasco a 37 graus Celsius sob dióxido de carbono de 5% em uma incubadora umidificada. Cerca de 95% dos parasitas se diferenciarão em amastigotes após 24 horas.
Centrifugar a cultura de amastigotes extracelulares por 15 minutos a 2.100 vezes G, e descartar o supernatante. Resuspenha a pelota com tampão de eletroporação contendo solução de suplemento fornecida para uma densidade celular final de uma vez 10 a 8ª células por mililitro. Alíquota de 100 microlitadores dos parasitas resuspended em tubos de microcentrífugo de 1,5 litro.
Em seguida, adicione cinco a 10 microgramas de Guia RNA, e misture suavemente por pipetação. Transfira a mistura para um cuvette de eletroporação de dois milímetros e aplique um pulso com o dispositivo de eletroporação. Em seguida, transfira o conteúdo de cuvette em um frasco T-25, contendo cinco mililitros de meio LIT pré-armado, deixe a tampa solta e incuba o frasco a 37 graus Celsius sob 5% de dióxido de carbono.
Monitore o crescimento celular seja por continuação da cultura axeônica ou como amastigotes intracelulares após infecção celular hospedeira. Se monitorar o crescimento celular como amastigotes axenic, agite suavemente o frasco para resuspensar os amastigotes extracelulares na solução, e misturar 20 microlitadores da cultura com um microlitra de solução de iodeto de propidium em um tubo de microcentrifuuge. É importante não deixar o frasco de cultura fora da incubadora por mais tempo do que o necessário, pois a temperatura é um dos fatores que permite a proliferação axeônica do amastigote.
Aplique a amostra em um hemótmetro e observe-a sob um microscópio de fluorescência. Em seguida, conte o número de amastigotes viáveis que não estão manchados por iodeto de propídio. Para monitorar o crescimento de células knockout como amastigotes intracelulares, as células 3T3 hospedadas em uma placa de 12 poços com DMEM.
Um dia após a eletroporação coletar os amastigotes nocaute por centrifugação, descartar o supernaspeuta, e resuspend os parasitas com dois mililitros de DMEM. Remova o meio da cultura da célula hospedeira e adicione os amastigotes resuspended. Incubar a placa a 37 graus Celsius abaixo de 5% de dióxido de carbono por dois dias, o que permitirá que os amastigotes estabeleçam uma infecção.
Após os dois dias, lave os amastigotes extracelulares fora das células host com DMEM e adicione DMEM fresco. Continue a incubação por mais dois dias e, em seguida, visualize os núcleos das células hospedeiras e dos amastigotes intracelulares. Foi demonstrado que os amastigotes T.Cruzi transfectados com o Guia RNA contra o gene essencial TcCGM1 mostram um defeito significativo de crescimento em comparação com um grupo controle.
Ao monitorar o crescimento como amastigotes intracelulares, a fração de núcleos hospedeiros associados aos núcleos T.Cruzi é significativamente menor no grupo de nocaute TcCGM1 em comparação com o controle. Pelo contrário, a transfecção do Guia RNA contra uma das proteínas de haste paraflagênitaS TcPAR1 não afeta significativamente o crescimento celular após quatro dias de cultivo axenic ou inibe o crescimento de amastigotes intracelulares. No entanto, cinco dias após a infecção, o número de tripulações que emergem da célula hospedeira é significativamente menor na co-cultura de nocaute TcPAR1 em comparação com a co-cultura de controle.
Além disso, os trypomastigotes diferenciados dentro da célula hospedeira no grupo de controle pareciam mais ativos do que os do grupo de nocaute. Este método também pode ser usado para estudar os efeitos de genes exógenos no estágio amastigote em vez de transfetar o Guia RNA em amastigote expresso em Cas9, você pode transfectar o plasmídeo em um amastigote do tipo selvagem para expressar um gene exógeno.
