Amastigote zorunlu hücre içi parazit olduğu için deneylerde T.cruzi'nin konak enfeksiyon evresini kullanmak zordur. Kültür tekniğimiz, amastigote'nin konak hücrenin dışında geçici olarak çoğalmasını sağlar, böylece parazitin klinik olarak uygun olan bu aşamasında doğrudan deneyler yapabiliriz. Prosedürü gösteren Yukie Akutsu, enstitümüzden bir teknisyen olacak.
El yazması talimatlara göre bir ev sahibi parazit co-kültür korumak. Cas9 ifade eden parazit farklılaşmaya hazır olduğunda, süpernatantı konik bir tüpe toplayın ve mikroskop altında numune kalitesini kontrol edin. Ekstrasellüler amastigotes önemli sayıda varsa, trypomastigotes izole etmek için bir yüzme-out prosedürü gerçekleştirin.
2, 100 kez G.Then tüp orta 0.5-1 mililitre bırakarak, supernatant en atın olarak on beş dakika boyunca trypomastigotes ve amastigotes karışımı aşağı spin. Tüpü gevşek bir şekilde kaplayın ve peleti 37 santigrat derecede 1-2 saat kuluçkaya yatırın, bu da aktif trypomastigotes'in peletten dışarı yüzmesini sağlayacaktır. Kuluçkadan sonra, trypomastigotes ile supernatant bir 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüp aktarın.
Aşağı çevirin ve 5 mililitre DMEM ile peleti yeniden askıya alın. Paraziti bir T-25 kültür şişesine aktarın ve şişeyi 37 derecede nemlendirilmiş bir kuvözde %5 karbondioksit inşâ edin. Parazitlerin yaklaşık %95'i 24 saat sonra amastigotes olarak ayrılacaktır.
Ekstrasellüler amastigotes kültürünü 2, 100 kez G'de 15 dakika santrifüj edin ve süpernatant'ı atın. Mililitre başına 8 hücreleri için bir kez 10 son hücre yoğunluğu için ek çözüm sağlanan içeren elektroporasyon tampon ile pelet resuspend. Aliquot 1.5 litre mikrosantrifüj tüpler içine resuspended parazitlerin 100 mikrolitre.
Sonra Kılavuz RNA beş ila 10 mikrogram ekleyin ve yavaşça pipetleme tarafından karıştırın. Karışımı iki milimetrelik bir boşluk elektroporasyon cuvette aktarın ve elektroporasyon cihazı ile bir darbe uygulayın. Daha sonra, cuvette içeriğini, beş mililitre önceden ısınmış LIT ortamı içeren bir T-25 şişesine aktarın, kapağı gevşek bırakın ve şişeyi %5 karbondioksitin altında 37 derecede kuluçkaya yatırın.
Ya eksenik culturing devamı ya da konak hücre enfeksiyonu sonrası hücre içi amastigotes olarak hücre büyümesini izlemek. Hücre büyümesini axenik amastigotes olarak izliyorsanız, çözeltinin içine ekstrasellüler amastigotes yeniden askıya almak için yavaşça şişe sallamak ve bir mikrosentrifuge tüp propidium iyodür çözeltisi bir mikrolitre ile kültürün 20 mikrolitre karıştırın. Kültür şişesini kuvöz dışında gereğinden uzun süre bırakmamak önemlidir, çünkü sıcaklık amastigote'nin baltanik çoğalmasını sağlayan faktörlerden biridir.
Örneği bir hemositometreye uygulayın ve floresan mikroskobu altında gözlemleyin. Sonra propidium iyodür ile lekeli olmayan canlı amastigotes sayısını saymak. Hücre içi amastigotes olarak nakavt hücrelerinin büyümesini izlemek için, tohum konak 3T3 hücreleri 12-iyi plaka DMEM ile.
Elektroporasyondan bir gün sonra nakavt amastigotes santrifüj tarafından toplamak, supernatant atmak ve DMEM iki mililitre ile parazitleri askıya. Ortamı ana hücre kültüründen çıkarın ve yeniden askıya alınan amastigotes'i ekleyin. Plakayı %5 karbondioksit ini altında 37 derecede iki gün boyunca kuluçkaya yatırın, bu da amastigotların enfeksiyon oluşturmasını sağlayacak.
İki gün sonra, DMEM ile konak hücrelerinin dışındaki hücre dışı amastigotes yıkayın ve taze DMEM ekleyin. Ek bir iki gün için kuluçka devam edin ve sonra konak hücrelerin çekirdekleri ve hücre içi amastigotes görselleştirmek. T.Cruzi amastigotes'in temel gen TcCGM1'e karşı Rehber RNA ile transfeced bir kontrol grubu ile karşılaştırıldığında önemli bir büyüme defekti gösterdiği gösterilmiştir.
Hücre içi amastigotes olarak büyüme izlenirken, T.Cruzi çekirdekleri ile ilişkili konak çekirdeklerinin fraksiyonu kontrole göre TcCGM1 nakavt grubunda anlamlı olarak daha düşüktür. Aksine, Paraflagellar çubuk proteinlerinden birine karşı Kılavuz RNA transfeksiyon UVI1 önemli ölçüde axenik culturing dört gün sonra hücre büyümesini etkilemez veya hücre içi amastigotes büyümesini inhibe. Ancak, beş gün sonrası, konak hücreden çıkan trypomastigotes sayısı kontrol co-kültüre göre TcPAR1 nakavt co-kültür önemli ölçüde daha düşüktür.
Ayrıca, kontrol grubunda konak hücre içinde farklılaştırılmış trypomastigotes nakavt grubunda olanlardan daha aktif göründü. Bu yöntem aynı zamanda amastigot evresindeki eksojen genlerin etkilerini incelemek için kılavuz RNA'yı Cas9 ifade eden amastigote dönüştürmek yerine, plazmidi eksojen bir geni ifade etmek için yabani tip bir amastigote dönüştürebilirsiniz.
