È difficile usare lo stadio di infezione ospite di T.cruzi negli esperimenti perché l'amastigote è un parassita intracellulare obbligato. La nostra tecnica di coltivazione consente all'amastigote di replicarsi temporaneamente al di fuori della cellula ospite, in modo da poter eseguire esperimenti direttamente su questa fase clinicamente rilevante del parassita. A dimostrare la procedura sarà Yukie Akutsu, un tecnico del nostro istituto.
Mantenere una co-coltura parassita ospite secondo le indicazioni del manoscritto. Quando il parassita che esprime Cas9 è pronto per la differenziazione, raccogli il supernatante in un tubo conico e controlla la qualità del campione al microscopio. Se esiste un numero significativo di amastigoti extracellulari, eseguire una procedura di swim-out per isolare le tripamastigoti.
Spin giù la miscela di tripamastigoti e amastigoti per quindici minuti come 2, 100 volte G.Quindi scartare la maggior parte del supernatante, lasciando da 0,5 a 1 millilitro di mezzo nel tubo. Cappucciare liberamente il tubo e incubare il pellet a 37 gradi Celsius per una o due ore, il che consentirà ai trypomastigoti attivi di nuotare fuori dal pellet. Dopo l'incubazione, trasferire il supernatante con i tripamastigoti in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri.
Spinlo verso il basso e rimospendi il pellet con 5 millilitri di DMEM. Trasferire il parassita in un pallone da coltura T-25 e incubare il pallone a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica in un incubatore umidificato. Circa il 95% dei parassiti si distinguerà in amastigoti dopo 24 ore.
Centrifugare la coltura degli amastigoti extracellulari per 15 minuti a 2, 100 volte G e scartare il supernatante. Resuspend il pellet con tampone di elettroporazione contenente la soluzione di supplemento fornita ad una densità cellulare finale di uno per 10 alle 8 ° celle per millilitro. Aliquot 100 microlitri dei parassiti rimescolati in tubi di microcentrifugo da 1,5 litri.
Quindi aggiungere da cinque a 10 microgrammi di RNA guida e mescolare delicatamente con la pipettazione. Trasferire la miscela in una cuvetta di elettroporazione gap di due millimetri e applicare un impulso con il dispositivo di elettroporazione. Quindi, trasferire il contenuto di cuvette in un pallone T-25, contenente cinque millilitri di mezzo LIT prebellico, lasciare il tappo sciolto e incubare il pallone a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica.
Monitorare la crescita cellulare per continuazione della coltura axenica o come amastigoti intracellulari dopo l'infezione delle cellule ospiti. Se si monitora la crescita cellulare come amastigoti axenici, agitare delicatamente il pallone per rimescolare gli amastigoti extracellulari nella soluzione e mescolare 20 microlitri della coltura con un microlitro di soluzione di ioduro propidio in un tubo di microcentrifugo. È importante non lasciare il pallone di coltura al di fuori dell'incubatore più a lungo del necessario perché la temperatura è uno dei fattori che consente la proliferazione axenica dell'amastigote.
Applicare il campione su un emocitometro e osservarlo al microscopio a fluorescenza. Quindi conta il numero di amastigoti vitali che non sono macchiati dallo ioduro di propidio. Per monitorare la crescita delle cellule knockout come amastigoti intracellulari, i semi ospitano cellule 3T3 in una piastra da 12 porri con DMEM.
Un giorno dopo l'elettroporazione raccogliere gli amastigoti knockout per centrifugazione, scartare il supernatante e rimescolare i parassiti con due millilitri di DMEM. Rimuovere il supporto dalle impostazioni cultura della cella host e aggiungere gli amastigoti rimorsi. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica per due giorni, il che consentirà agli amastigoti di stabilire un'infezione.
Dopo i due giorni, lavare via gli amastigoti extracellulari al di fuori delle cellule ospiti con DMEM e aggiungere DMEM fresco. Continuare l'incubazione per altri due giorni, quindi visualizzare i nuclei delle cellule ospiti e degli amastigoti intracellulari. È stato dimostrato che gli amastigoti T.Cruzi trasfettato con RNA guida contro il gene essenziale TcCGM1 mostrano un difetto di crescita significativo rispetto a un gruppo di controllo.
Quando si monitora la crescita come amastigoti intracellulari, la frazione dei nuclei ospiti associati ai nuclei T.Cruzi è significativamente inferiore nel gruppo knockout TcCGM1 rispetto al controllo. Al contrario, la trasfezione dell'RNA guida contro una delle proteine dell'asta paraflagellare TcPAR1 non influisce significativamente sulla crescita cellulare dopo quattro giorni di coltura axenica o inibisce la crescita degli amastigoti intracellulari. Tuttavia, cinque giorni dopo l'infezione, il numero di triplomastigoti che emergono dalla cellula ospite è significativamente inferiore nella co-coltura knockout TcPAR1 rispetto alla co-coltura di controllo.
Inoltre, le tripastigoti differenziate all'interno della cellula ospite nel gruppo di controllo sono apparse più attive di quelle del gruppo ad eliminazione diretta. Questo metodo può anche essere utilizzato per studiare gli effetti dei geni esogeni sullo stadio amastigote invece di trasfetto l'RNA guida in amastigote che esprime Cas9, è possibile trasfetto il plasmide in un amastigoto di tipo selvatico per esprimere un gene esogeno.
