כאן אנו מדגימים תב"ן סחר בתוכן גבוה התואם את ההכנה העיקרית לתרבות העצבית. שיטה זו מתייגת בנפרד את פני השטח מאגרי קולטן בין מרתפים של נוירונים קבועים. הפעלת הצגת נתונים כיחס של משטח מנורמל או צפיפות קולטן פנימית לצפיפות הכוללת של קולטן זה.
בדיקת התוכן הגבוה והסחר בקוולטנים מספקת אמצעים מושפעים למדידת שינויים בתפזורת בפרופילי סחר בקוטנים בתוך רשת עצבית בתגובה לגורמים שונים. צריכת הרבה פחות זמן וחומרים מאשר שיטות חלופיות. שיבושים וסחר כללים קושרו הפרעות נוירולוגיות מרובות, והם נחשבים מטרות אטרקטיביות לטיפול תרופתי.
לדוגמה מחקרים הראו אחד הסימנים המוקדמים ביותר של מחלת אלצהיימר הוא אובדן סינפטי ובריכות סינפטית וחלודות מופחתות. טכניקה זו דורשת שלבים רבים ושונים של קושי משתנה. במיוחד בגלל טיפול צלחת 96 היטב מניפולציה בארות יכול להוכיח קשה עבור מישהו ללא ניסיון.
ומכיוון שתוצאות הניסוי רגישות מאוד לטיפול לא תקין, כדאי להציג את השלבים השונים המבוצעים. מדריך להתחיל, להאכיל את הנוירונים בצלחת 96 גם על ידי הסרת 100 microliters של המדיה הקיימת מראש מכל באר. והחלפתו ב-100 מיקרוליטרים של מדיה שהתחממו מראש ל-37 מעלות צלזיוס.
כל שלושה עד ארבעה ימים. יום במבחנה 14, להשתמש multi-pipet כדי להסיר 100 microliters של מדיה מכל באר בריכה התקשורת. הוסף שני מיקרוליטרים של פתרון TTX Stock למיליליטר אחד של המדיה המותנית הממוזגת כדי ליצור פתרון של ארבעה מיקרומולרים של TTX.
לטפל בנוירונים בכל באר עם 100 microliters של פתרון TTX מיקרומולר. אם אין די מדיה של תנאי מאגר, הוסף חלק מהמדיה שאוחסנה קודם לכן. דגירה באינקובטור 5%CO2 ב 37 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות.
לאחר מכן להסיר את TTX הקיים המכיל מדיה ולהוסיף 200 microliters של מדיה עצבית מחוממת מראש, ו דגירה צלחת מיקרו בטמפרטורת החדר במשך רבע שעה. ראשית להסיר את התקשורת העצבית מהצלחת מיקרו. הוסף חמישים microliters של פתרון נוגדן אנטי gluA1 או אנטי gluA2 ל בארות המתאימות של צלחת מיקרו.
הוסף חמישים מיקרוליטרים של מדיה עצבית לתרנות הנוגדנים המשניות בלבד. דגירה בטמפרטורת החדר במשך עשרים דקות כדי לאפשר כריכת נוגדנים. לאחר מכן הסר את המדיה הקיימת מ- wells.
לשטוף את צלחת המיקרו שלוש פעמים עם 100 microliters של מדיה עצבית טמפרטורת החדר לכל באר כדי להסיר את כל נוגדנים מאוגדים. לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטרים 100 מיקרומולרים של פתרון מלאי DHPG לכל באר. דגירה באינקובטור 5%פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס במשך עשר דקות.
הבא להסיר את פתרון DHPG ולהוסיף 100 microliters של מדיה עצבית לכל באר. חזור על תהליך זה פעם נוספת. ואז דגירה באינקובטור 5%פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
ביום הניסוי להכין פתרון של 4% paraformaldehyde ו 4% סוכרוז NPBS. הסר את המדיה מכל באר והחלף אותה ב-100 מיקרוליטרים של פתרון הפרפורמלדהיד והסוקרוס. חזור על תהליך זה עבור כל נקודת זמן של חיבור.
דגירה צלחת מיקרו ב 4 מעלות צלזיוס במשך עשרים דקות. לאחר מכן להסיר את התיקון ולהוסיף 100 microliters של DPBS לכל באר. הסר את ה- DPBS והוסף 150 מיקרוליטרים של מאגר חסימה לכל באר.
דגירה בטמפרטורת החדר במשך תשעים דקות. הסר את מאגר החסימה והוסף 50 מיקרוליטרים של פתרון הנוגדנים המשני לכל באר. דגירה בטמפרטורת החדר במשך שישים דקות תוך שמירה על הצלחת מוגנת מפני אור.
הסר את פתרון הנוגדנים והוסף 100 מיקרוליטרים של TBS לכל באר. דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. חזור על תהליך זה, הסרת המדיה מה בארות הוספת TBS, ודגירה בטמפרטורת החדר ארבע פעמים נוספות.
לאחר מכן, להסיר את TBS מהצלחת מיקרו. הוסף 100 מיקרוליטרים של פתרון של 4%paraformaldehyde ו 4% סוכרוז ב PBS לכל באר. דגירה בטמפרטורת החדר במשך רבע שעה.
מוציאים את תספורפורמלדהיד ומוסיפים 100 מיקרוליטרים של TBS בכל באר, ודגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. חזור על שלב זה פעמיים נוספות. ראשית להכין פתרון של TBS המכיל 2% סאפונין ומערבולת הפתרון בקצרה כדי להמיס באופן מלא את אבקת סאפונין.
באמצעות מסנן 2 מיקרומטר, לסנן את הפתרון כדי להסיר את כל החלקיקים שיכולים לגרום לשפעת אוטומטית. הוסיפו 150 מיקרוליטרים של תסנובת 2%סאפונין זו לכל באר, והם דגירה בטמפרטורת החדר במשך רבע שעה. לאחר מכן הסר את פתרון סאפונין, והוסף 150 מיקרוליטרים של חיץ חסימה לכל באר.
דגירה בטמפרטורת החדר במשך תשעים דקות. לאחר מכן להסיר את מאגר החסימה ולהוסיף חמישים microliters של פתרון הנוגדן המשני לכל באר. דגירה בטמפרטורת החדר במשך שישים דקות.
לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטרים של TBS לכל באר ודגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. חזור על תהליך זה הוספת TBS ודגירה בטמפרטורת החדר ארבע פעמים נוספות. באמצעות מערכת הדמיית לייזר אינפרא אדום תמונה 96 גם מיקרו צלחת על פי הוראות היצרנים.
הגדר את רזולוציית הסריקה ל-84 מיקרומטר. איכות הסריקה לבינונית וההתמקדות מתקזזת בהתאם לגובה הבסיס של צלחת המיקרו 96 באר המשמשת. לחץ על כפתור התפריט Image Studio, לייצא תמונה עבור מדיה דיגיטלית, ולייצא את התמונות עם רזולוציה של 300 dpi בפורמט TIFF.
פתח את התמונה ב- ImageJ Fiji. לפצל את ערוצי הצבע על ידי לחיצה על תפריט התמונה ולאחר מכן צבע, לפצל ערוצים. לאחר מכן פתח את מנהל ההשקעות מהניתוח, כלים.
סמן את התיבה עבור תוויות במנהל ההשקעות, כדי לסווג את העיגולים עם מספרים. בערוץ 6 80, או בערוץ האדום, בחר את אזור העניין על-ידי בחירת הכלי עיגול וציור עיגול שמתאים במדויק לגם הראשון. לאחר מכן הקש Ctrl plus T וגרר את העיגול ל הבא.
חזור על תהליך זה עד שכל בארות הם בעיגול. ממדד לחץ על מנהל ההשקעות. בחר את הערכים המופיעים והעתק אותם לגיליון כפולה.
לאחר מכן לחצו על הערוץ הירוק והעבירו את ה-ROIs שנבחרו לתמונה. ממדד לחץ על מנהל ההשקעות. בחר את הערכים המופיעים והעתק אותם לגיליון כפולה.
לאחר מכן לחשב את השינויים ביטוי קולטן פני השטח כמתואר בפרוטוקול הטקסט. בהליך זה ההתמדה של קשת בוויסות סחר בקולטן אמפא נבדק באמצעות סחר בקולטן אמפא תוכן גבוה ובדיקה. נוירונים מטופלים עם חוסם ערוץ נתרן יון TTX אשר מעכב את פוטנציאל הפעולה ומפחית את רמות הקשת.
ואחריו DHPG אשר גורם תרגום קשת בכל מקום. הן פני השטח והן להפנים בריכות של gluA1 ו gluA2 המכילות תת-יוניקות קולטן apa נמדדו בחמש ורבע שעה לאחר שטיפת DHPG. נוירונים ArcKR להראות אנדוזיטוזיס gluA1 מוגברת כאשר מטופלים עם DHPG, לעומת נוירונים סוג בזמן.
אפקט זה אינו נראה כאשר נוירונים מטופלים עם TTX בלבד. ביטוי פני השטח של gluA2 subunit גדל באופן משמעותי בנקודות זמן קצרות לעומת נוירונים מסוג wile. ציון החלפת תת-אחת פוטנציאלית.
לבטח כי התאים הם paraformaldehyde קבוע illiquid צריך להיות מוכן טרי ביום הניסוי. יש לתקן מחדש תאים לאחר תיוג עבור קולטני פני השטח. שיטות אחרות כגון מיקרוסקופיה confocal יוכלו לספק רזולוציה חד תאית כדי לאפיין עוד יותר הקשורים השתנה במבנה העצבי לוקליזציה קולטן.
שיבוש הדינמיקה הזמנית של קשת משנה את הסחר קולטני אמפא בתגובה MgluR מתווך בע"מ. כיוונים עתידיים יהיה למדוד אמפא קולטנים סחר בתגובה לגירויים אחרים. הבדיקה הזו אולי ניתנת להתאמה לסוגי תאים אחרים, טיפולים וקולטנים אחרים, בתנאי שההליך מותאם בקפידה ומותקף כראוי.
יש לנקוט בזהירות כדי להבטיח כי צפיפות התא, זמני הטיפול, שלבי קיבעון, שלבי permeabilization, בחירות reagent ממוטבים המערכת של עניין. להשלמה מוצלחת ויעילה של הבדיקה חשוב להכין את פתרון DHPG ואת 4%paraformaldehyde, 4% פתרון סוכרוז ביום הניסוי. שליטה מטופלים היטב עם vakeel או TTX נדרשים כדי להבטיח כי ההשפעות שנצפו הם ספציפיים לטיפול.
זה גם קריטי לכלול בארות שטופלו רק בנוגדנים המשניים כדי לשלוט על פלואורסצנטיות רקע המיוצרת על ידי כריכה לא ספציפית.
