הפרוטוקול שלנו מתאר שיטה לבניית מודל RA. שיעור ההצלחה שלה הוא מעל 93 אחוזים ואת הפתוגנזה שלה תלויה בתאי T, תאי B, וחסינות המולדת, אשר מאפשר לחוקרים ללמוד טוב יותר את הפתוגנזה של RA מנקודת מבט חיסונית גלובלית. לאחר מכן אנו משתמשים בתאי INKT עם השפעות אימונומודולטוריות לטיפול בהם.
לתאי INKT יש השפעה טובה על הטיפול על ידי מבוא vivo המספקים תמיכה בסיסית בנתונים ליישום הקליני של תאי INKT ומפוצצים באמת את ערך היישום הקליני של תאי INKT. היתרון הגדול ביותר של טכנולוגיה זו הוא שזה פשוט לתפעול וקל להעתקה. הדגמת ההליך תהיה צ'ן שנגדה, גאו שיאנג, וג'אנג ג'ינגנן, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי.
כדי להתחיל, לשקול 1.75 מיליגרם של שניהם HGPI325 כדי 339 ו HGPI469 כדי 483 שברים ולהמיס אותם 5.25 מיליליטר של 4 מעלות צלזיוס משולש מים מזוקקים. ממיסים את ה-Adjuvant של Complete Freund באמבט מים של 50 מעלות צלזיוס. משוך 5.25 מיליליטר לתוך צינור צנטריפוגה 10 מיליליטר נוסף וקרר אותו לשימוש.
שים את התערובת של פתרון HG6PI ופתרון ה-Adjuvant של Complete Freund ביחידת אמולסיה מלאכותית עם שני מזרקי זכוכית, מחוברים. באמבט קרח, לדחוף את המזרק במהירות ותדירות קבועה של עשר עד עשרים פעמים בדקה כדי לחקות לחלוטין את פתרון פפטיד התערובת ולהשלים את הפתרון יידג'ובנט של פרוינד. לאחר מכן, לשמור את טיפות אמולסיה במים במשך עשר דקות.
לאחר מכן, להזריק 150 microliters של HG6PIs אמולסיה לתוך שורש הזנב של העכבר תת עורית. מיד ואחרי 48 שעות, להזריק 200 מיליגרם של רעלן שעלת לתוך העכבר תוך-אפינלי. עכשיו, להזריק עכבר DBA1 נורמלי תוך ניתוחית ללא גייזר במינון של 0.1 מיליגרם לקילוגרם של משקל גוף.
שלושה ימים לאחר הדוגמנות, לאחר הרדמה, לבודד את הטחול של העכבר. הכן השעיה של תא יחיד על ידי חיתוך ושחזה של הטחול במסנת רשת 200. לשטוף את ההשעיה התא עם PBS.
צנטריפוגה ב 200 פעמים g במשך חמש דקות ולהשליך את supernatant. להשעות מחדש את התאים עם מיליליטר אחד של פתרון רקמת דם שלמה. הוסף שלושה מיליליטר של מדיום הפרדת לימפוציטים עכבר.
ואז צנטריפוגה התאים במשך 20 דקות ב 300 פעמים גרם בטמפרטורת החדר. כדי לטהר את תאי INKT, יש להוסיף 10 לתאים השביעיים עם 100 מיקרוליטרים של ארבע מעלות צלזיוס PBS, להוסיף 10 מיקרוליטר של אלפא גאוסר טעון CD1 tetramer PE ולטגירה אותם ב 4 מעלות צלזיוס במשך רבע שעה בחושך. לשטוף את התאים פעמיים עם PBS ו resuspend אותם 80 microliters של PBS.
מוסיפים 20 מיקרוליטרים של מיקרוביאדות נגד PE ומדגרים אותן בארבע מעלות צלזיוס במשך עשרים דקות בחושך. לשטוף אותם פעמיים עם PBS ו resuspend התאים עם 500 microliters של PBS. מקם את עמודת המיון בשדה המגנטי של סדרן MACS ושטוף ב- 500 מיקרוליטרים של PBS.
הוסף את השעיית התא המוכן לעמודת המיון, אסוף את הזרימה דרך וטוף שלוש פעמים במאגר PBS. הסר את השדה המגנטי והוסף מיליליטר אחד של מאגר PBS לעמודת המיון. דחף במהירות את הבוכנה בלחץ מתמיד כדי לדחוף את התאים המסווים לתוך צינור האיסוף.
ולהשיג את תאי INKT מטוהרים. ספירה באמצעות מונה תאים אוטומטי. כדי לזהות את פנוטיפ התא INKT, ראשית, לקחת פעם אחת עשר עד השישי תאים מתאי INKT מטוהרים ולתלות אותם שוב 50 microliters של PBS.
הוסף 0.5 מיקרוליטרים של אלפא גאוסר PE CD1 tetramer, או 10 microliters של FITC TCR בטא בצינור הבקרה החיובי יחיד. הוסף 0.5 microliters של אלפא גאוס PE CD1 tetramer, להוסיף 10 microliters של FITC TCR בטא בצינור המדגם. דגירה אותם בארבע מעלות צלזיוס במשך שלושים דקות בחושך.
לאחר מכן, לשטוף את התאים PBS ולאחר מכן צנטריפוגה ב 200 פעמים g במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי והוסף מיליליטר אחד של פתרון העבודה של קיבוע FoxP3. ותדיגר את התאים במשך 45 דקות בארבע מעלות צלזיוס בחושך.
לאחר מכן, להוסיף מיליליטר אחד של פתרון עבודה 1x permeabilization ו צנטריפוגה התאים ב 500 פעמים גרם בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי. הוסף מיקרוליטר אחד של AlexaFluor 647 עכבר נגד PLZF ומיקרוליטר אחד של PerCP Cy5.5 עכבר נגד Tbet ודגירה במשך שלושים דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
לאחר מכן, להוסיף שני microliters של חיץ permeabilization פתרון עבודה צנטריפוגה ב 200 פעמים g במשך חמש דקות לניקוי. השלך את העל-טבעי. תן שימוש חוזר בתאים ב-500 מיקרוליטרים של PBS ולמדוד לפי ציטומטריית זרימה.
במחקר זה, בהשוואה לקבוצת הביקורת, הבהונות של קבוצת מודל RA החלו להראות נפיחות אדומה לאחר דוגמנות עם החמרה הדרגתית. ב 14 ימים, הנפיחות האדומה במפרק הקרסול הגיעה לשיאה ואחריה הקלה הדרגתית. התוצאות הפתולוגיות מראות כי מידת החדירה של תאים דלקתיים ברקמת הסינוביאלית בקרסול של עכברי מודל RA הייתה שונה בשלבים שונים.
שיא הדלקת התרחשה ביום 14 לאחר דוגמנות. בקבוצת המודל RA, רמות הסרום של ציטוקיני פרו דלקתיים גדלו באופן משמעותי 11 ימים ו 14 ימים לאחר הדוגמנות. בעוד ציטוקיני אנטי דלקתיים ירדו באופן משמעותי.
נתון זה מראה כי שיעור INKT2 בעכברים רגילים היה בסביבות חמישה אחוזים. שיעור INK2 היה כ 82 אחוזים לאחר אינדוקציה vivo. שיעור INK2 היה יותר מ 92 אחוזים לאחר טיהור MACS.
כאן אנו מראים שיטה לחקות את הפוליפפטיד העיקרי שאנו רואים ב- RA. טיפות אמולסיה נשמרים במים במשך 10 דקות. התוצאות מתפזרות. פרוטוקול זה הוא הרחבה חדשה לטיפול בתאי NKT מיוחדים שהועלו RA.
אשר ניתן ליישם כלפי אימונותרפיה התא או מחלות אוטואימוניות אחרות וגידולים. מודל זה יכול לעורר את ההתפשטות הכוללת של תאי CD4 T ותאי NKT גירעונות בחולים RA, אשר מניח את היסודות למחקר מעמיק של מסלולי החיסון RA. בפרוטוקול זה, רעלן שעלת מוזרק interperitoneally במהלך הדוגמנות.
נא ללבוש בגדים ניסיוניים וכפפות חד פעמיות. ולשאת את כל הסטנדרטים של פעולה כדי למנוע פצע דקירה זיהומים.
