תפקוד המיטוכונדריאלי הוא קריטי להתחדשות עצמית של תאי גזע hematopoietic. פעילות מיטוכונדרית היא רפלקטור של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלי הפנימי, אשר ניתן למדוד על ידי TMRM, פלואורסצנט תא, צבע קטורתי מחלחל לתא. משאבות אפלוקס קסנוביוטיות פעילות מאוד ב- HSC, וגורם לבלט TMRM.
היתרון העיקרי של פרוטוקול זה, הוא התיקון של אפקט זה, ניצול Verapamil, מעכב של משאבות efflux. התחל על ידי בידוד מח עצם מעצם הירך של העכבר. השתמש בזוג מדפים ומספריים חדים כדי לחתוך את שתי כפות הרגליים האחוריות.
ואז לעשות גפיים קטנות בעור הגחוני של העכבר, ולמתח אותו. מוציאים את עצם הירך ואת השוקה, תוך כדי טיפול לא לנתק את ראשי עצם הירך, ולמקם את העצמות בצלחת שש בארות, מלא 1.5 מיליליטר של חיץ מכתים. הסר את השרירים מן העצמות, לחתוך את הקצוות של העצמות, המאפשר מח עצם לצאת.
מניחים את העצמות ניקה בארות חדשות, עם 1.5 מיליליטר של חיץ כתמים. לאחר מכן, לשטוף את מח העצם עם מזרק שלושה מיליליטר ומחט 25 מד, עד העצם הופכת לבנה. לאסוף את כל התאים בצינור 1.5 מיליליטר, צנטריפוגה אותם במשך חמש דקות ב 180 פעמים G, ואז להשליך את העל טבעי.
בזהירות resuspend את גלולה ב 300 microliters של קרח קר ACK lysing חיץ, ולשים את התאים על הקרח במשך דקה אחת. לאחר מכן בטל מיד את הפעלת התזה על-ידי הוספת מיליליטר אחד של מאגר כתמים. צנטריפוגה התאים במשך חמש דקות ב 180 פעמים G.Resuspend גלולת התא, אשר אמור להיראות לבן, במיליליטר אחד של חיץ מכתים.
סנן את התאים באמצעות מכסה מסננת תאים, עם רשת ניילון 35 מיקרומטר, כדי להשיג תאים mononuclear. התחל על ידי הכנת קוקטייל שושלת היוחסין, ונוגדנים נדנים פלואורופור, על פי הוראות כתב היד. שמור את הנוגדנים על קרח, ומוגן מפני אור.
לאחר מכן, צנטריפוגה המדגם במשך חמש דקות ב 180 פעמים G, ולהשליך את supernatant. מוסיפים 400 מיקרוליטרים של קוקטייל השושלת, וארבעה מיקרוליטרים של נוגדנים BIOTINYLATED CD135 לכדור התא, ומערבולת את התערובת. ואז להחגירה אותו על קרח במשך 30 דקות.
לאחר הדגירה, לשטוף את המדגם על ידי הוספת שלושה מיליליטר של חיץ כתמים, לסובב אותו במשך חמש דקות ב 180 פעמים G, והשליכת supernatant. לאחר מכן מוסיפים 400 מיקרוליטרים של תותב נוגדנים, ומערבולת את התערובת. דגירה אותו על קרח במשך 30 דקות נוספות, ולחזור על לשטוף עם חיץ הכתמים.
כדי להכין את פתרון הכתמים TMRM, להוסיף 2.2 microliters של פתרון מלאי TMRM, ו 1.1 microliters של Verapamil, כדי 1.1 מיליליטר של מדיום תרבות hematopoietic ללא סרום, עם תרומבופויטין וגורם תאי גזע. תן מחדש את מח העצם במיליליטר אחד של תסנובת הכתמים של TMRM, מערבולת במהירות, ותדחק במשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס. סנן את הדגימה באמצעות כובע מסננת תאים, עם רשת ניילון 35 מיקרומטר, כדי למנוע סתימת ציטומטר הזרימה.
לאחר מכן הוסף מיקרוליטר אחד של DAPI והמשך עם ציטומטריית זרימה. הפעל את דגימת מח העצם, ולרכוש לפחות מיליון אירועים. לאחר מכן הציגו את התאים המונונוקלאריים של מח העצם החי בעלילה של כחול האוקיינוס השקט, כדי לזהות שברי CD135 Lin-negative ו-Lin חיוביים.
התווה את השבר ה-Lin-שלילי עבור APC/Cy7 לעומת PE/Cy7 כדי לזהות את הצאצא הרב-תכליתי או את שבר MPP. לאחר מכן התווה את שבר MPP עבור APC לעומת PerCP/Cy5.5, כדי לזהות את תא הגזע hematopoietic או שבר HSC. הצג את שבר HSC עבור FITC, או CD34, כדי לחלק אותו לשברים HSC שליליים של CD34 ו- CD34 חיוביים HSC.
לבסוף לרכוש את עוצמת TMRM בכל אוכלוסייה. כדי להבטיח כי כתמי TMRM פעלו כראוי, להוסיף מיקרוליטר אחד של FCCP לדגימה, לריכוז סופי של מילימולר אחד, ולהדגיר אותו ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. אז תרכוש מיליון אירועים.
לאחר הוספת FCCP, יש להגדיל באופן דרסטי את עוצמת TMRM. פרוטוקול זה שימש בהצלחה לכימות פוטנציאל קרום המיטוכונדריאלי באוכלוסיות תאים שונות, עם צבע TMRM. הוכח כי נוכחותם של PBS ו- FBS במדיום התרבות משפיעה על עוצמת האות TMRM.
ולכן חשוב לבצע כתמי TMRM במדיום הרחבה ללא סרום. תאי גזע hematopoietic לבטא רמות פעילות גבוהות של משאבות פלקס קסנוביוטי כי להחדיר צבע TMRM. אז פרופילי TMRM משתנים גם בנוכחות Verapamil או Cyclosporin H, אשר חוסמים את המשאבות.
כדי לאמת את הדיוק של כתמי TMRM, FCCP יכול להיות depolarize המיטוכונדריה, ולהפחית את עוצמת TMRM. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בקלות לחקר HSC עם צבע פוטנציאלי ממברנה מיטוכונדריאלי שונה, כולל TMRE או JC-1. כמו גם צבעים מיטוכונדריאליים אחרים כגון MitoTracker או MitoSOX.
הנושאים הקריטיים שירשו הפעילות השונה של משאבות אפלוקס בקרב אוכלוסיית מח העצם הצביעו רק לאחרונה. אז פרוטוקול זה נועד להפחית את הפער בין ממצאים קודמים.
