פרוטוקול זה הוא מוצ"ש פשוט המבוסס על ציטומטריית זרימה המאפשר מדידה של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית והמסה המיטוכונדרית בתאים חיים. מיסי מטבוליים סטנדרטיים נכשלים כאשר עובדים עם אוכלוסיות נדירות כגון תאי גזע hematopoietic. שיטה זו מאפשרת למשתמשים פרופיל קרום מיטוכונדריאלי בעת עבודה עם מספר נמוך של תאים ולקבוע אפנונים מטבוליים חדשניים של תאים כגון HSCs.
יתר על כן, אתה יכול לשלב את זה עם בדיקות תפקודיות במורד הזרם כגון השתלת מח עצם או בדיקות יוצרות מושבה כדי לקבוע את הפונקציונליות של התאים שלך לאחר התרבות. הטכניקה שלנו יכולה להיות מנוצלת לזיהוי של מולקולות חדשות המסוגלות לשפר את תפקוד HSC בהקשר של השתלת מח עצם והתאוששות חיסונית hematopoietic לאחר טיפולים אבלטיביים. כפי שמתואר בפרוטוקול שלנו, השיטה שלנו יכולה לשמש להערכת כושר מטבולי של תאי T חיסוניים.
חשוב מאוד כי התאים יש חשיפה מינימלית לאור לאחר הכתם. יתר על כן, השימוש verapamil מעכבי משאבה יש לכלול על מנת להעריך את התרומה של שפעת המשאבה. עם זאת, משתמשים צריכים להיות מודעים לכך verapamil עמוק מטריד שיווי משקל יוני ולא ניתן להשתמש בהם כדי להעריך את ההשפעה של אפנן מטבולי על פוטנציאל קרום המיטוכונדריאלי.
הדגמה חזותית של שיטה זו חשובה ביותר מכיוון שיש כמה צעדים קריטיים שצריך לזכור בעת עבודה עם מספר נמוך של תאים, וצעדים אלה חסרים לעתים קרובות מאוד בעיתונים הרגילים שמשתמשים קוראים ב- PubMed. עבור מיון FAC, אוכלוסיית LKS, המוגדרת על-ידי שושלת שלילית, Sca1 חיובי, cKit חיובי מזוהה. תאי גזע hematopoietic מסביבות חמישה עד 10% מהתאים באוכלוסיית LKS מזוהים על ידי gating עבור CD150 חיובי, CD48 אוכלוסייה שלילית, שכותרתו HSCs.
לאחר מיון תאי גזע hematopoietic, צנטריפוגה הצינורות ב 300 פעמים g במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. בעדינות להסיר את רוב supernatant מבלי לסלק את גלולה, ולהשאיר 50 עד 80 microliters על גבי גלולת התא. תן שימוש חוזר את גלולת התא בהרחבת תאי גזע בינוני לנפח סופי של 200 מיקרוליטרים.
הכינו תרבות רקמה סטרילית שטופלה ב-96 צלחת בארות U-bottom, וזהו את בארות המקום שבו התאים יתורבו. העבר 100 microliters של מדיום בסיס 2x שהוכן בעבר בארות אלה. ב NR מסומן היטב, להוסיף שני microliters של פתרון ריבוזיד 100x nicotinamide.
מעבירים 100 מיקרוליטרים של מדיום בסיס פי 2 לתוך בארות לבקרת כתמים. זרעים 100 microliters של תאי גזע hematopoietic מוכן על גבי הבארים המכילים מדיום בסיס 2x. זרעים 100 מיקרוליטרים של תאי מח עצם שלמים על בארות המסומנים כפקדי כתמים.
הוסף 200 מיקרוליטרים של מים autoclaved בכל בארות שמסביב כדי להפחית אידוי מ בארות המכילות תאים. מניחים את הצלחת באין מפריע באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני במשך 72 שעות. מוציאים את הצלחת כדי לחדש את הריבוזיד של הניקוטינמיד כל 24 שעות, ומכניסים אותו בחזרה לאנקובטור.
בסוף תקופת התרבות, להוסיף שני microliters של פתרון TMRM 100x ושני microliters של פתרון כתם פלואורסצנטי ירוק 100x בכל בארות הבדיקה. הוסף שני מיקרוליטרים של TMRM 100x בבקרת הכתמים TMRM היטב. הוסיפו שני מיקרוליטרים של כתם פלואורסצנטי ירוק פי 100 בבקרת הכתמים של MitoTracker.
מכסים את החלק העליון של הצלחת בנייר אלומיניום. ומ מניחים את הצלחת בחזרה באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני במשך 45 דקות. מוציאים את הצלחת מהאינקובטור, וצנטריפוגה אותו ב 300 פעמים גרם במשך חמש דקות.
הפוך את הלוח כדי להסיר את העל-טבעי, והוסף 200 מיקרוליטרים של מאגר FACS סטנדרטי כדי לעשות שימוש חוזר. מכסים את הצלחת בנייר כסף. צנטריפוגה הצלחת ב 300 פעמים g במשך חמש דקות.
חזור על שלב כביסה זה שלוש פעמים. תן שימוש חוזר בתאים ב- 200 מיקרוליטרים של מאגר FACS, והעבר לצינורות FACS. כדי להפעיל את הדגימות על ציטומטר הזרימה, טען תחילה את פקדי הצבע הבודדים למכונה והקליט לפחות 5,000 אירועים בכל אחד מהם.
בתוכנה, הקש Acquire ולאחר מכן הקלט בלוח המחוונים כדי להשיג ולהקליט פקדי צבע בודדים. לחץ על הגדרת פיצוי ולחץ על חשב פיצוי כדי לחשב את הפיצוי. לאחר החלת הפיצוי, לרכוש את מדגם תאי גזע hematopoietic, ולתרשם אירועים רבים ככל האפשר.
יצא את קבצי FACS מהציטרומטר, ופתח את הקובץ בתוכנת הניתוח. ב- FlowJo, השתמש פיזור קדימה פיזור בצד gating כדי לזהות את אוכלוסיית התא. זהה סינגלים בשערים הבאים ולאחר מכן התווה את השבר השלילי DAPI המייצג תאים חיים.
בשער התא החי, ליצור חלקת מתאר בתעלת TMRM וכתם פלואורסצנטי ירוק כדי למדוד את הפוטנציאל המיטוכונדריאלי קרום מסה, בהתאמה. ייצוא עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת של שני ערוצים אלה בשער התא החי. לאחר מכן, יצא את חלקם של התאים בשער הנמוך TMRM בכל הדגימות.
הטיפול בריבוזיד ניקוטינימיד הראה עלייה ברורה באוכלוסייה הנמוכה של TMRM. זה גם הגדיל באופן משמעותי את שיעור התאים בשער הנמוך TMRM והראה ירידה משמעותית של עוצמת פלואורסצנטיות TMRM. מסה מיטוכונדרית לא השתנה על תוספי ריבוזיד nicotinamide.
בנוסף, כתמי סמן תאי גזע שולבו עם כתמים מיטוכונדריאליים לאחר התרבות. עם אסטרטגיית gating לזיהוי תאי גזע hematopoietic, חשיפה ריבוזיד nicotinamide הראה עלייה משמעותית באוכלוסייה נמוכה TMRM וירידה משמעותית בעוצמת פלואורסצנטיות TMRM ב- HSCs מגודרים. האות הירוק של כתם המיטוכונדריה הירוק נותר ללא שינוי בשני התנאים.
חשוב לכסות את צלחת הכתמים בנייר אלומיניום על מנת למזער את החשיפה של אור לדגימות מוכתמות. שיטה זו יכולה להיות משולבת עם מיסי במורד הזרם כגון השתלת מח עצם ו assays יוצרי המושבה כדי לקבוע את הפונקציונליות של תאי הגזע שלך. אז טכניקה זו מאפשרת שיטת הקרנה פשוטה לזיהוי אפנונים מטבוליים חדשניים של HSCs.
