Questo protocollo consente di garantire un buon isolamento delle vescicole extracellulari e la notifica di un maggior numero di proteine EBDF. Rispetto ad altre tecniche di isolamento, questa sostiene che si tratta di più integrità e attività verticali. I veicoli elettrici sono sempre più studiati in LC e in condizioni patologiche.
Questo metodo può essere applicato a tutti i sistemi che scegliamo di caratterizzare e studiare i veicoli elettrici. Per quel contenuto o per l'etica biologica è necessaria un'attenzione particolare quando si iterano i veicoli elettrici, poiché nella cultura si traduce nei seguenti esperimenti. Una dimostrazione visiva è fondamentale per ospitare attrezzature specifiche come una colonna cromatografica di esclusione delle dimensioni fatta in casa, nonché il coinvolgimento del contatore delle nanoparticelle e dello spettrometro di massa.
A dare prova della procedura sarà Antonella Raffo-Romero, del laboratorio. Inizia pre-isolando le vescicole extracellulari, o EV, dal mezzo di condizione. Trasferire la condizione in mezzo di coltura da colture di microglia o macrofagi in un tubo conico e centrifugarla a 1.200 volte G per 10 minuti per pellettare le cellule.
Trasferire il supernatante in un nuovo tubo conico e centrifugare per altri 20 minuti per eliminare i corpi apoptotici. Quindi trasferire il supernatante in un tubo di policarbonato da 10,4 millilitri. Posizionare il tubo in un rotore da 70,1 TI e ultra centrifugare a 100.000 volte G per 90 minuti a quattro gradi Celsius per pellettare i veicoli elettrici.
Dopo la centrifugazione, scartare il supernatante e rimescolare il pellet in 200 microlitri di PBS filtrato da 0,2 micrometri. Per isolare i veicoli elettrici, preparare una colonna cromatografica di esclusione di dimensioni fatte in casa lavando e sterilizzando una colonna cromatografica in vetro e posizionando un filtro a 60 microliter nella parte inferiore. Impilare la colonna con matrice di base di filtrazione del gel di agarosio collegata incrociata per creare una fase stazionaria di 0,6 centimetri di diametro e 20 centimetri di altezza.
Quindi risciacquare la fase con 50 millilitri di PBS filtrato da 0,2 micro metri. Se necessario, archiviare la colonna a quattro gradi Celsius per un uso successivo. Posizionare il pellet EV rimorsio sulla fase stazionaria e raccogliere 20 frazioni sequenziali di 250 microlitri continuando ad aggiungere PBS alla parte superiore della fase stazionaria.
Le frazioni possono essere conservate a meno 20 gradi Celsius. Per eseguire un'analisi di tracciamento delle nanoparticelle, effettuare una diluizione di ogni frazione con PBS filtrato da 0,2 micrometri e vortice per eliminare gli aggregati. Mettere la soluzione in una siringa da un millilitro e posizionarla nella pompa automatica per siringhe.
Quindi, regola le impostazioni della fotocamera in base al livello di guadagno dello schermo e al livello della fotocamera appropriati e fai clic su Esegui. Caricare il campione nella camera di analisi con una velocità di infusione di 1000 per 15 secondi. Quindi diminuire e stabilizzare il flusso di velocità per la registrazione video a una velocità di infusione di 25 per 15 secondi.
Cattura tre video consecutivi di 60 secondi del flusso di particelle. Quindi regolare il livello della fotocamera e la soglia di rilevamento prima dell'analisi video. Fare clic su Impostazioni OK per avviare l'analisi e quindi su Esporta al termine.
Lavare il sistema con un millilitro di PBS filtrato da 0,2 micrometri tra ogni frazione. Se si esegue l'analisi della microscopia elettronica, utilizzare un filtro centrifugo da 50 kilodalton per concentrare le frazioni di cromografia di esclusione delle dimensioni di interesse. Per l'estrazione di proteine, mescolare 50 microlitri di tampone RIPA con il campione EV per cinque minuti sul ghiaccio.
Sonicare i campioni tre volte a 500 Watt e 20 kilohertz per cinque secondi. Quindi rimuovere i detriti vescicolari centrifugando a 20.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver isolato le proteine, eseguire la migrazione proteica nel gel impilamento di un gel poliacrilico al 12%.
Mescolare le proteine nel gel con Coomassie Blue per 20 minuti a temperatura ambiente. Quindi asportare ogni pezzo di gel colorato e tagliarlo a pezzetti. Metti i pezzi di gel attraverso una serie di lavaggi successivi come descritto nel manoscritto.
Quindi asciugarli completamente con un concentratore sottovuoto. Dopo l'essiccazione eseguire la riduzione proteica con 100 microlitri di bicarbonato di ammonio millimolare contenente 10 millimolare ditiothreitol per un'ora a 56 gradi Celsius. Successivamente eseguire l'alchilazione proteica con 100 microlitri di bicarbonato di ammonio millimolare contenente 50 iodoacetamide millimolare per 45 minuti al buio.
Lavare i pezzi di gel secondo le indicazioni del manoscritto e asciugarli completamente sul concentratore sottovuoto. Eseguire la digestione proteica con 50 microlitri di tripsideina in bicarbonato di ammonio millimolare a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, estrarre le proteine digerite dal gel con 50 microlitri di 100%ACN per 30 minuti a 37 gradi Celsius e quindi 15 minuti a temperatura ambiente con agitazione continua.
Quindi estrarre le proteine due volte con 50 microlitri di 5%TFA in bicarbonato di ammonio millimolare da 20 millimolare, mescolando continuamente per 20 minuti. Aggiungere 100 microlitri di ACN e continuare a mescolare per 10 minuti. Successivamente, asciugare le proteine e rimornerne in 20 microlitri dello 0,1% di TFA.
Desalt il campione utilizzando una punta di pipetta da 10 microliter con mezzi di fase inversa C 18 per dissalarare e concentrare i peptidi. Quindi eluderli con ACN e acido formico dello 0,1%. Asciugare completamente il campione con un concentratore sottovuoto e rimescolarlo in 20 microlitri di ACN e acido formico allo 0,1% per la spettrometria di massa tandem della cromatografia liquida, o LC-MS.
Caricare i peptidi digeriti nello strumento ed eseguire un'analisi del campione. Per confermare l'isolamento dell'EV, ogni frazione SCC è stata sottoposta ad un'analisi di tracciamento delle nanoparticelle. Il numero di particelle era significativamente più alto nelle frazioni cinque, sei e sette.
Queste frazioni sono state raggruppate in un campione 2F-EV positivo, e confrontate con frazioni negative EV, 1F-EV negativo e 3F-EV negativo, utilizzando l'analisi western blot. I risultati hanno mostrato la presenza di proteine dello shock termico 90 nel campione positivo di veicoli elettrici e nel controllo del glisato cellulare. La microscopia elettronica del campione positivo di veicoli elettrici ha mostrato veicoli elettrici in un intervallo di dimensioni di circa 100 nanometri e 400 nanometri.
L'analisi della proteomica è stata eseguita al fine di identificare le proteine contaminanti in campioni negativi EV e caratterizzare il contenuto proteico dei veicoli elettrici. Le proteine identificate sono state confrontate tra 1F-EV negativo e un campione positivo 2F-EV, così come tra 2F-EV positivo e un campione negativo 3F-EV. Utilizzando questo metodo non mirato, un pool di 536 proteine sono state sottoposte al database ExoCarta e hanno portato all'identificazione di 86 proteine associate all'EV.
Inoltre, questo pool ha anche permesso l'identificazione delle interazioni proteiche e delle relative funzioni biologiche. È stato scoperto che le proteine del campione positivo EV hanno svolto ruoli in percorsi immunitari e neuroprotettivi. Gli effetti dei veicoli elettrici derivati dalla microglia sono stati valutati sulla crescita della neurite con cellule PC 12 e neuroni primari del ratto.
Un aumento significativo della crescita è stato osservato nell'ambito dei veicoli elettrici rispetto al controllo. I veicoli elettrici derivati dai macrofagi sono stati valutati sull'invasione delle cellule del glioma. Si è scoperto che i veicoli elettrici compromettevano la crescita e l'invasione degli sferoidi glioma.
La cosa più importante da ricordare è scartare davvero attentamente il supernatante della fase di ultracentrifugazione al fine di prevenire la perdita di veicoli elettrici in questa procedura. Favoriamo un approccio su larga scala e non mirato per concentrarci sull'intero contenuto proteico e quindi sull'effetto verticale dei veicoli elettrici. quindi il contenuto negli acidi nucleici può essere associato usando l'analisi.
Con questo approccio da una cultura primaria, siamo in grado di discriminare tra proteine EV e proteine libere che sono al di fuori della varietà. Quindi la domanda rimane se questa coagulazione è artefatto o meglio qualche altro reale
