Bu protokol, ekstrasellüler veziküllerin iyi bir şekilde izole edilmesinin ve daha fazla sayıda EBDF proteininin bildirilmesinin mümkün olmasını sağlar. Diğer izolasyon teknikleri ile karşılaştırıldığında, bu daha bütünlük ve dikey faaliyetleri olduğunu korur. EVs lc yanı sıra patolojik koşullarda daha fazla çalışılmaktadır.
Bu yöntem, evleri karakterize etmeyi ve incelemeyi seçtiğimiz sistemlere uygulanabilir. Bu içerik veya biyolojik etik için, aşağıdaki deneylerde olduğu gibi, evleri yinelerken özel dikkat gereklidir. Görsel bir gösteri, ev yapımı boyut dışlama kromatografisi sütunu gibi belirli ekipmanların yanı sıra nanopartikül sayacı ve kütle spektrometresinin katılımıiçin önemlidir.
Prosedürün gösterilmesine yardımcı olan laboratuvardan Antonella Raffo-Romero olacak. Hücre dışı vezikülleri veya EVs'i durum ortamından önceden izole ederek başlayın. Durumu mikroglia veya makrofaj kültürlerinden konik bir tüpe aktarın ve 1, 200 kez G'de 10 dakika boyunca hücreyi peletlemek için santrifüj edin.
Apoptotik organları ortadan kaldırmak için başka bir 20 dakika için yeni bir konik tüp ve santrifüj içine supernatant aktarın. Sonra supernatant bir 10.4 mililitre polikarbonat tüp içine aktarın. Tüpü 70,1 TI rotorve ultra santrifüje 100,000 kez G'de, 4 santigrat derecede 4 derece yeterek yerleştirin.
Santrifüjden sonra, supernatant atın ve 0,2 mikrometre filtrelenmiş PBS 200 mikrolitre pelet resuspend. EVs izole etmek için, yıkama ve bir cam kromatografi sütun sterilize ve alt 60 mikrolitre filtre yerleştirerek bir ev yapımı boyutu dışlama kromatografi sütun hazırlamak. Çapı 0,6 santimetre ve yüksekliği 20 santimetre sabit bir faz oluşturmak için çapraz bağlı agarose jel filtrasyon baz matris ile sütun yığını.
Daha sonra 0,2 mikro metre filtrelenmiş PBS 50 mililitre ile faz durulayın. Gerekirse, daha sonra kullanmak üzere sütunu dört santigrat derecede saklayın. Sabit fazın üstüne yeniden askıya alınan EV peletini yerleştirin ve sabit fazın üstüne PBS eklemeye devam ederken 250 mikrolitrenin 20 ardışık fraksiyonlarını toplayın.
Kesirler eksi 20 derecede saklanabilir. Bir nanopartikül izleme analizi gerçekleştirmek için, 0,2 mikrometre filtrelenmiş PBS ve girdap ile her kesir bir seyreltme yapmak agregaları ortadan kaldırmak için. Bir mililitreşile şırınga çözeltisi koyun ve otomatik şırınga pompası yerleştirin.
Ardından, kamera ayarlarını uygun ekran kazanç düzeyine ve kamera seviyesine ayarlayın ve Çalıştır'a tıklayın. Numuneyi analiz odasına 15 saniye boyunca 1000 infüzyon hızıyla yükleyin. Daha sonra, video kaydı için hız akışını 15 saniye boyunca 25'lik bir infüzyon hızına düşürün ve sabitleyin.
Parçacık akışının art arda üç 60 saniyelik videosunu yakalayın. Ardından video analizinden önce kamera düzeyini ve algılama eşiğini ayarlayın. Analizi başlatmak için Ayarlar Tamam'a tıklayın ve yapıldığında Dışa Aktar'a tıklayın.
Sistemi her fraksiyon arasında 0,2 mikrometre filtrelenmiş PBS mililitre ile yıkayın. Elektron mikroskobu analizi yapıyorsanız, 50 kilodalton santrifüj filtre kullanarak boyut dışlama kromatografisi fraksiyonlarını yoğunlaştırıyor. Protein ekstraksiyonu için, 50 mikrolitre RIPA tamponu ile EV örneğini beş dakika boyunca buz üzerinde karıştırın.
Örnekleri 500 Watt ve 20 kilohertz'de beş saniye boyunca üç kez sonicate edin. Daha sonra 20,000 kez G'de 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüj ederek vesiküler enkaz çıkarın. Proteinleri izole ettikten sonra, %12 poliakrilik jelin istifleme jelinde protein göçü gerçekleştirin.
Jeldeki proteinleri coomassie blue ile oda sıcaklığında 20 dakika karıştırın. Sonra her renkli jel parça çıkarmak ve küçük parçalar halinde kesti. El yazmasında açıklandığı gibi, jel parçalarını bir dizi ardışık yıkıntıya koyun.
Sonra tamamen bir vakum konsantratörü ile kuru. Kurutma sonra 56 santigrat derece bir saat boyunca 10 milimolar Dithiothreitol içeren 100 milimolar amonyum bikarbonat 100 mikrolitre ile protein azaltma gerçekleştirin. Daha sonra karanlıkta 45 dakika boyunca 50 milimolar iodoacetamide içeren 100 milimolar amonyum bikarbonat 100 mikrolitre ile protein alkiliyasyonu gerçekleştirin.
Jel parçalarını el yazması talimatlara göre yıkayın ve vakum konsantratörü üzerinde tamamen kurulayın. Bir gecede 37 santigrat derecede 20 milimolar amonyum bikarbonat 50 mikrolitre tripsin ile protein sindirimi gerçekleştirin. Ertesi gün, 37 santigrat derece 30 dakika ve daha sonra oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 100 ACN 50 mikrolitre ile jel sindirilmiş proteinleri ayıklayın sürekli karıştırma ile.
Daha sonra 20 milimolar amonyum bikarbonat% 5TFA 50 mikrolitre ile iki kez protein ayıklayın, sürekli karıştırarak 20 dakika. 100 mikrolitre ACN ekleyin ve 10 dakika karıştırmaya devam edin. Daha sonra, proteinlerkuru ve% 0.1 TFA 20 mikrolitre onları resuspend.
Desalting ve konsantre peptidler için C 18 ters faz medya ile 10 mikrolitre pipet ucu kullanarak örnek desalt. Sonra ACN ve% 0.1 formik asit ile onları elver. Numuneyi bir vakum konsantratörü ile tamamen kurutun ve sıvı kromatografi tandem kütle spektrometresi veya LC-MS için 20 mikrolitre ACN ve %0,1 formik asit te resuspend.
Sindirilmiş peptidleri alete yükleyin ve bir örnek analizi yapın. EV izolasyonu onaylamak için, her SCC fraksiyonu bir nanopartikül izleme analizine tabi tutuldu. Parçacık sayısı 5, altı ve yedi kesirlerde anlamlı olarak daha yüksekti.
Bu kesirler bir örnek 2F-EV pozitif olarak birleştirilmiş ve Batı leke analizi kullanılarak EV negatif fraksiyonları, 1F-EV negatif ve 3F-EV negatif ile karşılaştırıldı. Sonuçlar, EV pozitif örneklemde ve hücre lysat kontrolünde ısı şok proteini 90'ın varlığını gösterdi. EV pozitif numunesinin elektron mikroskobu nda 100 nanometre ve 400 nanometre boyutlarında ev ler saptanmis.
EV negatif örneklerinde kirletici proteinleri belirlemek ve EV'lerin protein içeriğini karakterize etmek amacıyla proteomik analiz yapıldı. Tanımlanan proteinler 1F-EV negatif ve 2F-EV pozitif örnekleri ile 2F-EV pozitif ve 3F-EV negatif örnekleri arasında karşılaştırıldı. Bu hedefsiz yöntem kullanılarak, ExoCarta veritabanına 536 proteinden oluşan bir havuz gönderildi ve 86 EV ilişkili proteinin tanımlanmasına yol açtı.
Buna ek olarak, bu havuz da protein etkileşimleri ve ilişkili biyolojik fonksiyonların belirlenmesi için izin verdi. EV pozitif örneklemdeki proteinlerin immün ve nöroprotektif yollarda rol oynadığı bulunmuştur. Mikroglia kaynaklı EVs etkileri PC 12 hücreleri ve sıçan primer nöronlar ile neurite outgrowth üzerinde değerlendirildi.
EVs altında kontrole göre önemli büyüme artışı gözlendi. Glioma hücre invazyonunda makrofaj türetilmiş EV'ler değerlendirildi. EVs'lerin glioma spheroidlerinin büyümesini ve istilasını bozdığı bulunmuştur.
Hatırlanması gereken en önemli şey, bu işlemde EV kaybını önlemek için ultracentrifugation adımının supernatant'ını gerçekten dikkatli bir şekilde atmaktır. Tüm protein içeriğine ve daha sonra EVs'lerin dikey etkisine odaklanmak için büyük ölçekli ve hedefsiz bir yaklaşımdan yanayız. böylece nükleik asitlerdeki içerikler analiz kullanılarak ilişkilendirilebilir.
Birincil kültürün bu yaklaşımı ile, EV proteinleri ile çeşitli olmayan serbest proteinler arasında ayrım yapabiliyoruz. Yani soru bu pıhtılaşma sanatsal ya da daha doğrusu başka bir gerçek olup olmadığı kalır
