פרימיקין היא תרופה ידועה נגד מלריה. הקביעה של primaquine בנוזלים ביולוגיים נדרשת לעתים קרובות כדי להעריך את הפרמקוקינטיקה. נכון לעכשיו, הטכניקות העיקריות לקביעת Primaquine מבוססות על HPLC.
ההליכים של HPLC יכולים להיות די מסובכים וגוזלים זמן. אז שיטה זו מציעה דרך פשוטה לגילוי מהיר של Primaquine. שיטת Griess זו היא אולי הדרך הפשוטה והחסכונית ביותר לכמיית Primaquine.
יתר על כן, שיטה זו יכולה להציע אפשרויות לגילוי Primaquine בעין בלתי ללא דרישה של כל ציוד. מלבד דגימות סרום ושתן, שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לקבוע כמותית Primaquine ניסוחים התרופות, למשל, קביעת Primaquine בטבליות לייצור בקרת איכות. הדגמת ההליך תהיה מיס וו יאלן וו שנגג'ון, שני סטודנטים לתואר שני מהמעבדה שלי.
התחל על ידי המסת 0.1 מילימולים של אנילין ופרימיקין ביפוספט לתוך 10 מיליליטר של 5%תמיסת חומצה זרחנית בבקבוקון תחתון חום 25 מיליליטר. מניחים את הבקבוק על אמבט קרח, ומוסיפים בר ערבוב. ואז לשים את אמבט הקרח על צלחת ערבוב.
ממיסים 6.9 מיליגרם של נתרן חנקתי ומיליליטר אחד של מים מקוררים ומוסיפים אותו לבקבוקון מבחינת טיפה. הסר את אמבט הקרח ולשמור על תערובת התגובה תוך ערבוב בטמפרטורת החדר. נטר את התגובה באמצעות כרומטוגרפיה מצופה ג'ל סיליקה או צלחת TLC, באמצעות תערובת מתנול דיכלורומתאן כאלונט.
מוצר האזו מציג כתמים צבעוניים על צלחת TLC. עצור את התגובה כאשר כתמי PMQ נעלמים. להתאים את ה- pH של תערובת התגובה ליותר מ 10 על ידי הוספת פתרון נתרן הידרוקסידי לאמבט קרח.
לאחר מכן, השתמש משפך הפרדה 50 מיליליטר כדי לחלץ את התערובת שלוש פעמים עם 20 מיליליטר של אתיל אצטט לכל מיצוי. בסיום, מערבבים ומרכזים את השלב האורגני תחת ואקום באמצעות אידוי סיבובי. לטהר את השאריות באמצעות כרומטוגרפיה פלאש עם ג'ל סיליקה פאזה הפוכה תחת לחץ רגיל.
לאחר מכן, לייבש את הפתרון על ידי lyophilization כדי להשיג את המוצר הרצוי אזו. כדי למדוד את ספקטרום ה-UV מול הספיגה, ממיסים את האזו הטהור במים מזוקקים או 5% חומצה זרפורית, ולהשתמש בספקטרופוטומטר כדי לתעד את ספקטרום הספיגה בטמפרטורת החדר. כדי למדוד את ספיגת PMQ, התחל על ידי המסת 4-methoxyaniline ב 0.2 מימן כלורי טוחן עבור פתרון 200 מילימולארי אנילין.
ואז להמיס נתרן ניטריס במים מזוקקים כדי להשיג פתרון חמישה מילימולרים. שמור את הפתרונות בארבע מעלות צלזיוס. הוסף 100 מיקרוליטרים של פתרון אנילין לצלחת 96 באר.
לאחר מכן הוסיפו 50 מיקרוליטרים של הדגימה המכילה PMQ, וערבבו אותה עם האנילין. מוסיפים 50 מיקרוליטרים של פתרון נתרן ניטרט לצלחת, ומערבבים את התוכן על ידי צינורות. שמור את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות, ולאחר מכן למדוד את ספיגת הפתרון ב 504 ננומטר.
יצא את הנתונים כקובץ גיליון אלקטרוני לניתוח נוסף. כדי לבנות עקומת כיול למדידות PMQ בדגימות שתן, הכינו פתרונות PMQ בשתן סינתטי בריכוזים של אפס, אחד, שניים, חמישה, 10, 20, 50, 100 ו-200 מיקרומולרים. הכן את תגובת הזיהוי של PMQ ולמדוד ספיגה כמתואר לעיל.
לאחר מכן צור עקומת כיול המבוססת על ספיגת 504 ננומטר וריכוזי PMQ. הפחת את ערכי הספיגה של הדגימות ללא PMQ ממדידות הבדיקה, ובצע התאמה ליניארית כדי ליצור משוואה ליניארית y שווה x פלוס b, כאשר y הוא הספיגה והתמדה, ו- x הוא הריכוז של PMQ. כדי לבנות עקומת כיול למדידת PMQ בדגימות סרום אנושיות, הכן פתרונות PMQ בסרום אנושי עם ריכוזי PMQ של אפס, אחד, שניים, חמישה, 10, 20, 50, 100 ו- 200 מיקרומולרים.
הכן את תגובת PMQ. למדוד ספיגה ולבנות את עקומת הכיול כפי שתואר קודם לכן. הוסף שישה מיליליטר של שבעה עד אחד אתיל אצטט הקסאן לשני מיליליטר של סרום המכיל PMQ בצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר.
מוסיפים 100 מיקרוליטרים של שתי תותבת נתרן הידרוקסידית טוחנת למערכת החילוץ, ומערבולת הצינור במשך 30 שניות. לאחר מכן, לאסוף את השכבה האורגנית ולרכז אותו עם אידוי סיבובי תחת ואקום. ממיסים את השאריות ב-200 מיקרוליטרים של מים מזוקקים, ומסננים דרך קרום בגודל נקבוביות בצורת דיסק, בגודל 220 ננומטר, כדי להסיר רכיבי שומנים בלתי מסיסים.
בנה את עקומת הכיול עבור PMQ במים מזוקקים, ולאחר מכן הכן תגובת זיהוי עם הפתרון שחולץ בצלחת 96 באר כפי שתואר קודם לכן, ולמדוד ספיגה. לאחר מכן, לקבוע את הריכוז של PMQ על פי המשוואה ליניארית מעקומות הכיול. תנאי התגובה היו אופטימיזציה באמצעות אנילינים שונים לזוג עם PMQ באמצעות התגובה Griess.
חישובים תיאורטיים בוצעו, והתוצאות היו בהסכמה טובה עם מדידות אופטיות. נקבע כי 4-methoxyaniline היה אופטימלי עבור תגובת זיהוי PMQ, בשל הביצועים הטובים שלה ואת שיעור התגובה, מיסות המוצר, ויציבות. יתר על כן, המוצר azo עבור 4-methoxyaniline הוא אדום בצבע, אשר קל להבחין עם עיניים עירומות.
ההשפעות של pH על UV מול ספיגת המוצר azo ופתרונות PMQ נבדקו. בעוד הגדלת ה-pH מ-1.0 ל-7.0 אינה משנה את הספיגה, ל-pH הבסיסי יש השפעה משמעותית. עקומות כיול נבנו לגילוי PMQ בדגימות שתן וסרום.
מערכת יחסים ליניארית נמצאה כאשר PMQ נע בין אפס ל 200 micromolar בשתן, ו מ 10 עד 200 מיקרומולר בסרום. כדי לדמות סרום אמיתי המכיל PMQ, PMQ נוסף לתוך סרום אנושי ב 0, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0 מיקרומולרים ריכוזים. באמצעות פרוטוקול זה, הריכוזים התאוששו נמצאו 0.02, 0.14, 0.44, 0.90, ו 1.78 micromolar, וכתוצאה מכך 90% התאוששות עבור ריכוזים מעל 0.5 micromolar.
יש לציין כי הזמן לתגובה להגיע לעוצמתה הרוויה תלוי בטמפרטורה. בדרך כלל, 10 עד 20 דקות מספיקות לטמפרטורה שבין 20 ל -30 מעלות צל"ש. עם זאת, כדי לסכם את הדוגמה שלנו של כימיה Griess לגילוי primaquine.
עיצוב דומה מתאים גם למולקולות רלוונטיות אחרות שיש להן תגובתיות כימית דומה לזו של פרימטווין.
