Primaquine ist ein bekanntes Anti-Malaria-Medikament. Die Bestimmung von Primaquin in biologischen Flüssigkeiten ist häufig erforderlich, um die Pharmakokinetik zu bewerten. Derzeit basieren die hauptsten Techniken zur Primaquine-Bestimmung auf HPLC.
Die Verfahren von HPLC können recht kompliziert und zeitaufwändig sein. Diese Methode bietet also eine einfache Möglichkeit zur schnellen Erkennung von Primaquine. Diese Griess-Methode ist potenziell der einfachste und kostengünstigste Weg zur Primaquine-Quantifizierung.
Darüber hinaus kann diese Methode Möglichkeiten für die Primäraufnahme mit bloßem Auge ohne jegliche Ausrüstung bieten. Neben Serum- und Urinproben könnte diese Methode auch zur quantitativen Bestimmung von Primaquin in pharmazeutischen Formulierungen eingesetzt werden, beispielsweise bei der Bestimmung von Primaquin in Tabletten zur Herstellung von Qualitätskontrolle. Demonstrieren das Verfahren werden Miss Wu Yalan und Wu Shengjun, zwei Studentin aus meinem Labor.
Beginnen Sie mit der Auflösung von 0,1 Millimolen Anilin und Primaquin-Biphosphat in 10 Milliliter 5%Phosphorsäurelösung in einem 25 Milliliter braunen Bodenkolben. Legen Sie den Kolben auf ein Eisbad, und fügen Sie eine Rührstange hinzu. Dann das Eisbad auf eine Rührplatte stellen.
6,9 Milligramm Natriumnitrat und einen Milliliter gekühltes Wasser auflösen und tropfenweise in den Kolben geben. Entfernen Sie das Eisbad und halten Sie die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur rühren. Überwachen Sie die Reaktion mit einer Kieselgel-beschichteten, dünnschichtigen Chromatographie oder TLC-Platte, wobei ein Dichlormethan-Methanolgemisch als Eluent verwendet wird.
Das Azo-Produkt weist farbige Flecken auf der TLC-Platte auf. Beenden Sie die Reaktion, wenn die PMQ-Spots verschwinden. Stellen Sie den pH-Wert des Reaktionsgemisches auf mehr als 10 an, indem Sie einem Eisbad Eine Natriumhydroxidlösung zusetzen.
Verwenden Sie dann einen 50 Milliliter Trenntrichter, um die Mischung dreimal mit 20 Milliliter Ethylacetat pro Extraktion zu extrahieren. Kombinieren und konzentrieren Sie die organische Phase unter Vakuum mit einem Rotationsverdampfer. Reinigen Sie die Rückstände mit Flash-Chromatographie mit Reverse-Phase-Kieselgel unter Normaldruck.
Dann trocknen Sie die Lösung durch Lyophilisierung, um das gewünschte Azo-Produkt zu erhalten. Um die UV-Vis-Absorptionsspektren zu messen, lösen Sie den reinen Azo in destilliertem Wasser oder 5% Phosphorsäure auf und verwenden sie das Spektralphotometer, um die Absorptionsspektren bei Raumtemperatur aufzuzeichnen. Um die PMQ-Absorption zu messen, beginnen Sie mit der Auflösung von 4-Methoxyaniin in 0,2 moligem Chlorwasserstoff für eine 200 Millimolar-Aniinlösung.
Dann Natriumnitrit in destilliertem Wasser auflösen, um eine fünfmillimolarige Lösung zu erhalten. Halten Sie die Lösungen bei vier Grad Celsius. 100 Mikroliter der Aniinlösung zu einer 96-Well-Platte geben.
Dann 50 Mikroliter der PMQ-haltigen Probe hinzufügen und mit dem Aniline vermischen. 50 Mikroliter der Natriumnitritlösung auf die Platte geben und den Inhalt durch Pipettieren mischen. Halten Sie die Platte 15 Minuten bei Raumtemperatur auf, und messen Sie dann die Absorption der Lösung bei 504 Nanometern.
Exportieren Sie die Daten als Tabellenkalkulationsdatei zur weiteren Analyse. Um eine Kalibrierkurve für PMQ-Messungen in Urinproben zu erstellen, bereiten Sie PMQ-Lösungen im synthetischen Urin in Konzentrationen von Null, eins, zwei, fünf, 10, 20, 50, 100 und 200 Mikromolaren vor. Bereiten Sie die PMQ-Erkennungsreaktion vor, und messen Sie die Absorption wie zuvor beschrieben.
Generieren Sie dann eine Kalibrierkurve basierend auf der Absorption von 504 Nanometern und den PMQ-Konzentrationen. Subtrahieren Sie die Absorptionswerte der Proben ohne PMQ von den Testmessungen und führen Sie eine lineare Anpassung aus, um eine lineare Gleichung y gleich x plus b zu erzeugen, wobei y die Absorptions- und //tensity und x die Konzentration von PMQ ist. Um eine Kalibrierkurve für die PMQ-Messung in menschlichen Serumproben zu erstellen, bereiten Sie PMQ-Lösungen im menschlichen Serum mit PMQ-Konzentrationen von null, eins, zwei, fünf, 10, 20, 50, 100 und 200 Mikromolaren vor.
Bereiten Sie die PMQ-Reaktion vor. Messen Sie die Absorption, und konstruieren Sie die Kalibrierungskurve wie zuvor beschrieben. Fügen Sie sechs Milliliter von sieben zu einem Ethylacetat Hexan in zwei Milliliter PMQ-haltiges Serum in einem 15 Milliliter Zentrifugenrohr hinzu.
Fügen Sie dem Extraktionssystem 100 Mikroliter zweier molarer Natriumhydroxidlösung hinzu und wirbeln Sie das Rohr für 30 Sekunden aus. Dann die organische Schicht sammeln und mit einem Rotationsverdampfer unter Vakuum konzentrieren. Lösen Sie den Rückstand in 200 Mikroliter destilliertem Wasser auf und filtern Sie durch eine scheibenförmige, 220 Nanometer porengroße Membran, um unlösliche Lipidkomponenten zu entfernen.
Konstruieren Sie die Kalibrierkurve für PMQ in destilliertem Wasser, bereiten Sie dann eine Detektionsreaktion mit der extrahierten Lösung in einer 96-Well-Platte vor, wie zuvor beschrieben, und messen Sie die Absorption. Bestimmen Sie dann die PMQ-Konzentration gemäß der linearen Gleichung aus der Kalibrierkurve. Die Reaktionsbedingungen wurden durch die Verwendung verschiedener Anilines optimiert, um pmQ durch die Griess-Reaktion zu koppeln.
Theoretische Berechnungen wurden durchgeführt, und die Ergebnisse waren in gutem Einvernehmen mit optischen Messungen. Es wurde festgestellt, dass 4-Methoxyaniin aufgrund seiner guten Leistung und Reaktionsgeschwindigkeit, Produktlöslichkeit und Stabilität optimal für die PMQ-Erkennungsreaktion war. Darüber hinaus ist das Azo-Produkt für 4-Methoxyaniline rot in der Farbe, die leicht mit nackten Augen zu unterscheiden ist.
Getestet wurden die Auswirkungen des pH-Werts auf die UV-Absorption des Azoprodukts und der PMQ-Lösungen. Während die Erhöhung des pH-Werts von 1,0 auf 7,0 die Absorption nicht verändert, hat der pH-Grundeffekt einen signifikanten Effekt. Kalibrierkurven wurden für den Nachweis von PMQ in Urin- und Serumproben konstruiert.
Eine lineare Beziehung wurde gefunden, wenn PMQ von null bis 200 Mikromolar im Urin und von 10 bis 200 Mikromolar im Serum reicht. Um ein echtes PMQ-haltiges Serum zu simulieren, wurde PMQ bei 0, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0 Mikromolarenkonzentrationen in das humane Serum gegeben. Mit diesem Protokoll wurden die wiedergewonnenen Konzentrationen auf 0,02, 0,14, 0,44, 0,90 und 1,78 Mikromolar ermittelt, was zu einer 90%igen Erholung bei Konzentrationen über 0,5 Mikromolar führte.
Es sollte beachtet werden, dass die Zeit für die Reaktion, um ihre gesättigte Intensität zu erreichen, temperaturabhängig ist. Normalerweise reichen 10 bis 20 Minuten für Temperaturen zwischen 20 und 30 Grad Celsius. Zum Abschluss unseres Beispiels der Griess-Chemie zur Primaquine-Erkennung.
Ähnliches Design eignet sich auch für andere relevante Moleküle, die eine ähnliche chemische Reaktivität wie Primaquin haben.
