Примахин является известным противомалярийным препаратом. Определение примакина в биологических жидкостях часто требуется для оценки фармакокинетики. В настоящее время основные методы определения Primaquine основаны на HPLC.
Процедуры HPLC могут быть довольно сложными и трудоемкими. Таким образом, этот метод предлагает простой способ быстрого обнаружения Primaquine. Этот метод Griess потенциально является самым простым и экономически эффективным способом количественной оценки Primaquine.
Кроме того, этот метод может предложить возможности для обнаружения невооруженным глазом Primaquine без требования любого оборудования. Помимо образцов сыворотки и мочи, этот метод также может быть использован для количественного определения Primaquine в фармацевтических формулировках, например, определение Primaquine в таблетках для контроля качества производства. Демонстрация процедуры будет мисс Ву Ялан и У Shengjun, два аспиранта из моей лаборатории.
Начните с растворения 0,1 миллимолей анилина и примакина бифосфата в 10 миллилитров 5%фосфорной кислоты в 25-миллилитровой коричневой нижней колбе. Положите колбу на ледяную ванну, и добавить перемешать бар. Затем положите ледяную ванну на тарелку для перемешивания.
Растворите 6,9 миллиграмма нитрата натрия и один миллилитр охлажденой воды и добавьте его в колбу капельно-мудрый. Удалите ледяную ванну и держите реакционной смеси перемешивания при комнатной температуре. Мониторинг реакции с кремнезема гель покрытием, тонкослойной хроматографии или TLC пластины, используя смесь дихлорметана метанола в качестве элюента.
Продукт азо выставлял цветные пятна на пластине TLC. Остановите реакцию, когда пятна ПМЗ исчезнут. Отрегулируйте рН реакционной смеси до более чем 10, добавив раствор гидроксида натрия в ледяную ванну.
Затем используйте воронку разделения 50 миллилитров, чтобы извлечь смесь три раза с 20 миллилитров этилового ацетата на извлечения. Когда закончите, объединить и сконцентрировать органическую фазу под вакуумом с помощью роторного испарителя. Очистить остатки с помощью флэш-хроматографии с обратной фазы кремнезема гель под нормальным давлением.
Затем высушите раствор путем лиофилизации, чтобы получить желаемый продукт азо. Для измерения спектра поглощения УФ-излучения растворяют чистое азо в дистиллированной воде или 5%фосфорной кислоте и используют спектрофотометр для записи спектров поглощения при комнатной температуре. Чтобы измерить поглощение ПМЗ, начните с растворения 4-мероксианилина в 0,2 моларного хлорида водорода для 200 миллимолярского анилина.
Затем растворите нитрит натрия в дистиллированной воде, чтобы получить пятимилолярный раствор. Держите растворы на уровне четырех градусов по Цельсию. Добавьте 100 микролитров анилинового раствора в пластину из 96 колодец.
Затем добавьте 50 микролитров образца, содержащего ПМЗ, и смешайте его с анилином. Добавьте в тарелку 50 микролитров раствора нитрита натрия и смешайте содержимое с помощью пипетки. Держите пластину при комнатной температуре в течение 15 минут, затем измерьте абсорбт раствора на 504 нанометров.
Экспорт данных в качестве файла электронной таблицы для дальнейшего анализа. Чтобы построить кривую калибровки для измерений ПМЗ в образцах мочи, подготовьте растворы ПМЗ в синтетической моче при концентрациях ноль, один, два, пять, 10, 20, 50, 100 и 200 микромолеров. Подготовьте реакцию обнаружения ПМЗ и измерьте абсорбт, как описано ранее.
Затем создайте кривую калибровки на основе абсорбции 504 нанометров и концентраций ПМЗ. Вычесть значения абсорбанса образцов без ПМЗ из тестовых измерений, и выполнить линейный подходят для создания линейного уравнения у равно х плюс b, где у является абсорбт и напряжение, и х является концентрация ПМЗ. Чтобы построить кривую калибровки для измерения ПМЗ в образцах сыворотки крови человека, подготовьйте растворы ПМЗ в сыворотке крови человека с концентрацией ТЧЗ ноль, один, два, пять, 10, 20, 50, 100 и 200 микромолей.
Подготовь реакцию ПМЗ. Измерьте абсорбцию и создайте кривую калибровки, как описано ранее. Добавьте шесть миллилитров семи-одного этилового ацетата шестиугольника в два миллилитра сыворотки, содержащей ПМЗ, в 15-миллилитровую центрифугу.
Добавьте 100 микролитров двух молярных гидроксидных растворов натрия в систему экстракции и вихрь трубки в течение 30 секунд. Затем соберите органический слой и сконцентрировать его с помощью роторного испарителя под вакуумом. Растворите остатки в 200 микролитров дистиллированной воды, и фильтр через дискообразной, 220 нанометровой поры размера мембраны для удаления нерастворимых липидных компонентов.
Постройте кривую калибровки для ПМЗ в дистиллированной воде, затем подготовьте реакцию обнаружения с извлеченным раствором в пластине из 96 колодец, как описано ранее, и измерьте абсорбцию. Затем определите концентрацию ПМЗ в соответствии с линейным уравнением из кривой калибровки. Реакция условия были оптимизированы с помощью различных anilines в паре с ПМЗ через реакцию Griess.
Были проведены теоретические расчеты, и результаты были в хорошем согласии с оптическими измерениями. Было установлено, что 4-мезоксиалин является оптимальным для реакции обнаружения ПМЗ, благодаря своей хорошей производительности и скорости реакции, растворимости продукта и стабильности. Кроме того, продукт азо для 4-мезоксиалин красного цвета, который легко отличить невооруженным глазом.
Были протестированы эффекты рН на поглощение УФ-излучения препарата азо и растворов ПМЗ. Хотя увеличение рН с 1,0 до 7,0 не меняет абсорбанса, основной рН имеет значительный эффект. Кривые калибровки были построены для обнаружения ПМЗ в образцах мочи и сыворотки.
Линейная связь была обнаружена, когда ПМЗ колеблется от нуля до 200 микромолей в моче и от 10 до 200 микромолеров в сыворотке крови. Для имитации реальной сыворотки, содержащей ПМЗ, ПМЗ был добавлен в сыворотку крови человека в концентрациях микромоляров 0, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0. С помощью этого протокола было установлено, что восстановленные концентрации составили 0,02, 0,14, 0,44, 0,90 и 1,78 микромолара, что привело к 90%-му восстановлению концентраций с концентрацией с более чем 0,5 микромолара.
Следует отметить, что время реакции для достижения ее насыщенной интенсивности зависит от температуры. Как правило, от 10 до 20 минут достаточно для температуры от 20 до 30 градусов по Цельсию. Однако, чтобы заключить наш пример химии Griess для обнаружения primaquine.
Аналогичная конструкция также подходит для других соответствующих молекул, которые имеют аналогичную химическую реактивность, как примахин.
