プリマキンは、よく知られている抗マラリア薬です。生物学的流体中のプリマキンの決定は、多くの場合、薬物動態を評価するために必要とされる。現在、プリマキン定量の主要な技術はHPLCに基づいています。
HPLCの手順は非常に複雑で時間がかかる場合があります。したがって、この方法は、プリマキンの迅速な検出のための簡単な方法を提供しています。このGriess法は、プリマキン定量のための最もシンプルで費用対効果の高い方法である可能性があります。
さらに、この方法は、任意の機器の要件なしに肉眼プリマキン検出のための可能性を提供することができます。血清および尿サンプルに加えて、この方法は、医薬品製剤中のプリマキンを定量的に決定するためにも使用することができ、例えば、製造品質管理のための錠剤中のプリマキンの決定。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の2人の大学院生である呉ヤランさんとウー・シェンジュンさんです。
25ミリリットルの茶色の底フラスコに5%リン酸溶液の10ミリリットルにアニリンとプリマキンバイリン酸の0.1ミリモルを溶解させることから始めます。フラスコを氷浴に置き、かき混ぜるバーを加えます。その後、攪拌板の上に氷浴を置きます。
硝酸ナトリウム6.9ミリグラムと冷却水1ミリリットルを溶解し、フラスコに滴下に加えます。氷浴を取り除き、反応混合物を室温で攪拌し続けます。シリカゲルコーティング、薄層クロマトグラフィーまたはTLCプレートで反応を監視し、ジクロロメタンメタノール混合物を溶出剤として使用します。
この製品はTLCプレートに着色スポットを示します。PMQスポットが消えたら反応を止める。水酸化ナトリウム溶液を氷浴に添加して、反応混合物のpHを10以上に調整します。
次いで、50ミリリットルの分離漏斗を使用して、抽出ごとに20ミリリットルの酢酸エチルで混合物を3回抽出する。終了したら、ロータリーエバポレーターを使用して真空下で有機相を組み合わせて濃縮します。フラッシュクロマトグラフィーを使用して残基を通常の圧力で逆相シリカゲルで精製します。
次いで、凍結乾燥により溶液を乾燥させ、所望のアゾ生成物を得る。UVビス吸収スペクトルを測定するには、蒸留水または5%リン酸に純粋なアゾを溶解し、分光光度計を使用して室温で吸収スペクトルを記録します。PMQ吸収を測定するには、4-メトキシアニリンを0.2モル塩化水素に200ミリモルアニリン溶液に溶解させることから始めます。
次いで、亜硝酸ナトリウムを蒸留水に溶解し、5ミリモル溶液を得た。ソリューションを摂氏4度に保ちます。アニリン溶液100マイクロリットルを96ウェルプレートに加えます。
その後、PMQ含有サンプルの50マイクロリットルを加え、アニリンと混合します。50マイクロリットルの亜硝酸ナトリウム溶液をプレートに加え、内容物をピペットで混ぜます。プレートを室温で15分間保ち、504ナノメートルで溶液の吸光度を測定します。
さらに分析するために、データをスプレッドシート ファイルとしてエクスポートします。尿サンプル中のPMQ測定用の較正曲線を構築するには、合成尿中のPMQ溶液を、ゼロ、1、2、5、10、20、50、10、50、100、200マイクロモルの濃度で調製します。PMQ検出反応を調製し、前述のように吸光度を測定する。
次いで、504ナノメートルの吸光度とPMQ濃度に基づいて較正曲線を生成します。試験測定からPMQを使用しないサンプルの吸光度値を引き、線形適合を行い、yが吸光度とテンシティ、xがPMQの濃度である線形方程式y xプラスbを生成します。ヒト血清サンプル中のPMQ測定用の較正曲線を構築するには、PMQ濃度がゼロ、1、2、5、10、20、50、50、100、および200マイクロモルのヒト血清中にPMQ溶液を調製します。
PMQ反応を準備します。吸光度を測定し、前述のように較正曲線を構築する。15ミリリットルの遠心分離チューブに7~1エチル酢酸ヘキサンを2ミリリットルのPMQ含有血清に加えます。
2つの水酸化ナトリウム溶液の100マイクロリットルを抽出システムに加え、30秒間チューブを渦液します。次に有機層を回収し、真空下でロータリーエバポレーターで濃縮します。残留物を200マイクロリットルの蒸留水に溶解し、円盤状の220ナノメートルの孔サイズの膜を通して濾過し、不溶性脂質成分を除去する。
蒸留水中にPMQ用の較正曲線を構築し、次に、先に述べた96ウェルプレートに抽出した溶液を用いて検出反応を調製し、吸光度を測定します。次に、較正曲線から直線式に従ってPMQの濃度を決定する。反応条件は、グリース反応を通じてPMQと結合するために様々なアニラインを使用して最適化した。
理論計算を行い、光学測定との結果がよく一致した。4-メトキシアニリンは、その良好な性能と反応速度、製品の溶解性、および安定性のために、PMQ検出反応に最適であると判断した。また、4-メトキシアニリン用のアゾ製品は赤色で、裸眼で見分けやすい。
アゾ製品とPMQ溶液のUV吸入に対するpHの効果を試験した。pHを 1.0 から 7.0 に増やしても吸光度は変化しませんが、基本的な pH は大きな効果を持ちます。尿および血清サンプル中のPMQの検出のために較正曲線を構築した。
PMQが尿中の0から200マイクロモル、血清中の10〜200マイクロモルの範囲である場合、線形関係が見つかりました。PMQ含有血清を実際にシミュレートするために、PMQをヒト血清に0,0.2,0.5,1.0,2.0マイクロモル濃度で添加した。このプロトコルを用いて、回収された濃度は0.02、0.14、0.44、0.90、および1.78マイクロモルであり、0.5マイクロモル以上の濃度に対して90%の回収をもたらした。
反応がその飽和強度に達するまでの時間は温度依存性である点に留意すべきである。通常、摂氏20~30度の温度では10~20分で十分です。しかし、プリマキン検出のためのグリース化学の例を締めくくる。
同様の設計は、プリマキンと同様の化学的反応性を有する他の関連分子にも適している。
