Questo modello microfluidico on-chip sul cancro che chiamiamo acceleratore dell'evoluzione, fornisce una piattaforma controllabile per studi quantitativi a lungo termine e in tempo reale sulla dinamica del cancro in condizioni ambientali ben definite a un singolo livello cellulare. La tecnologia ci permette di sondare le dinamiche evolutive del cancro in un panorama di stress simile a un tumore. Fornire informazioni tra cui morfologia, popolazione, motilità e migrazione nel tempo a livello cellulare.
Con la capacità di controllare e monitorare il comportamento delle popolazioni tumorali miste sotto gradienti di stress ben controllati, la nostra tecnologia può presentare un modello più fisiologicamente rilevante per lo sviluppo di farmaci preclinici. Il metodo di imballaggio di tenuta a pressione presentato può essere implementato anche in altri sistemi microfluidici che richiedono una sofisticata regolazione della composizione del gas ambientale e della capacità dell'esperimento a valle. La chiave per eseguire con successo un esperimento a lungo termine è garantire un ambiente fisicamente e biochimicamente stabile.
I fattori tra cui temperatura, umidità e composizione del gas devono essere monitorati in ogni momento. Per iniziare, fabbricare un supporto per piastre sufficiente a contenere piatti di coltura simultanei permeabili al gas su una macchina da stampa 3D. Svitare i componenti della piastra di campionamento personalizzata di tre pozzi con cacciavite.
Disinfettare i componenti tramite esposizione ai raggi UV per almeno un'ora e lasciare in un ambiente sterile. Per iniziare la semina della linea cellulare aggiungere cinque millilitri di tripside in ogni coltura cellulare PC3-Epi o PC3-EMT in un piatto di coltura di 10 centimetri ed eseguire la tripsininazione per cinque minuti in un incubatore a 37 gradi celsius. Trasferire le cellule dai piatti di coltura in tubi di centrifuga da 15 millilitri e quindi centrifugare a 150 volte g per tre minuti.
Scartare il supernatante. Sospendere di nuovo ciascuno dei pellet cellulari nei tubi di centrifuga da 15 millilitri e contare le celle di ogni PC3-MP o PC3-EMT utilizzando un emocitometro. Isolare un totale di 2,5 per 10 a quattro di ogni tipo di cella.
Mescolare i due tipi di celle isolate e aggiungere due millilitri di supporti di coltura. Semina due millilitri della coltura cellulare in ciascuno dei tre piatti di coltura permeabili al gas. Lasciare il gas permeabile nell'incubatrice a 37 gradi Celsius durante la notte affinché le cellule si attaccano.
Disinfettare i dispositivi PDMS tramite esposizione ai raggi UV per almeno un'ora e lasciare in un ambiente sterile. Ora impostate un sistema di alimentazione del gas composto sia da unità di controllo dell'anidride carbonica che dell'ossigeno, una pompa di gas, una camera di miscelazione del gas, un umidificatore o un bubbler, e tre serie separate di valvole a gas e manometri. In alternativa utilizzare un sistema di alimentazione del gas che fornisca condizioni di normoxia.
Assicurarsi che l'umidità relativa nella camera di miscelazione sia aumentata a oltre l'85%Impostare un'unità di controllo termico di incubazione sul palco a 37 gradi celsius con sottoassiemi di riscaldamento separate per il coperchio e la piastra inferiore. Il giorno dopo eseminare i piatti di coltura permeabili al gas dall'incubatore e identificare che i componenti dettagliati sono in ordine, Ogni pozzo possiede un portastoviglie di coltura permeabile al gas, un portachiavi PDMS, un porta finestrini in vetro e un paio di finestre di vetro larghe 35 millilitri. Utilizzare le viti montate per assemblare questi componenti e bloccare il piatto di coltura permeabile al gas.
Quindi trasferire il mezzo di coltura preri riscaldato in una camera a vuoto per de-gas per 20 minuti. Trattare il chip PDMS in un sistema al plasma di ossigeno per 30 secondi al fine di mantenere l'idrofilia. Successivamente caricare lentamente due siringhe con 10 millilitri di mezzi di crescita de-gassati e le altre due siringhe con 10 millilitri di reagente desiderato de-gassato di interesse.
Ad esempio media e media con droga. Collegare ogni singola siringa a un tubo di 50 centimetri con un ago di erogazione calibro 23 in un perno di acciaio cavo. Inserire un perno di acciaio cavo nell'altra estremità del tubo.
Spingere il supporto nel tubo per innescare il tubo e inserire il perno d'acciaio in ogni chip PDMS attraverso lo strato di tappatura. Riempire lo strato del serbatoio e bagnare il livello del modello PDMS con i supporti. Lo strato del serbatoio funziona come trappola a bolle su chip per impedire alle bolle d'aria di entrare nel modello microfluidico.
Quindi caricare una siringa da un millilitro con mezzi di coltura. Collegare la siringa a un tubo di cinque centimetri con un ago di erogazione calibro 23 in un perno di acciaio cavo. Inserire un perno di acciaio cavo nell'altra estremità del tubo e innescare il tubo.
Inserire il perno di acciaio cavo nel foro centrale del truciolo per estrarre in seguito mezzi eccessivi. Caricare due siringhe da 10 millilitri per chip nel ponte avanti e posizionare le altre due siringhe nel ponte di prelievo del sistema di siringhe. Al fine di evitare di intrappolare microbolle nel modello microfluidico, erogare un millilitro del supporto preri riscaldato e de-gassato nel piatto di coltura permeabile al gas profondo da 35 millilitri.
Posizionare i trucioli direttamente sopra le membrane di coltura permeabili al gas, dove il chip si avvicina alla superficie liquida con un angolo di inclinazione di 15 gradi. Bloccare il chip PDMS con il supporto del chip PDMS, spingendo il dispositivo PDMS verso il basso. Nastro un foglio di una sigillare sopra il dispositivo PDMS e morsetto con portachip PDMS, al fine di evitare che il chip si asciughi.
Impostare la portata del supporto intorno all'array su 20 microlitri all'ora. Posizionare l'intera piastra nell'incubatore sul palco sullo stadio motorizzato di un microscopio invertito. Collegare il sistema di alimentazione del gas ai canali del gas attraverso i tubi del gas e mantenere la pressione di gauge a 0,2 PSI.
Questo pressurizza la membrana di coltura permeabile al gas rispetto al chip PDMS installato per garantire la sigillatura del dispositivo. Estrarre lentamente mezzi eccessivi nel chip utilizzando la siringa da un millilitro dal foro centrale. Osservare il chip al microscopio durante l'estrazione del supporto e quindi interrompere l'estrazione quando il chip è sigillato.
Collegare l'unità di rilevamento della temperatura dell'incubatore sul palco alla piastra dei tre pozzi e impostare su 37 gradi celsius. In questo studio PC3 coltivato in un acceleratore di evoluzione senza la presenza di stress esterno aveva curve di crescita mentre era allineato. Suggerire l'identità del profilo di proliferazione cellulare in funzione della posizione attraverso il chip.
La pendenza iniziale delle curve rivela il tasso di proliferazione. Il tempo di raddoppio per le celle nel dispositivo è di circa 24 ore. GFP che esprimeva PC3-EMT e mCherry che esprimevano le cellule PC3-Epi rivestite erano co-coltivate nell'acceleratore di evoluzione.
A partire dal 40% di confluenza, la cocultura è cresciuta del 40% in tre giorni. Mentre la curva di crescita della confluenza totale è sotto forma di modello di crescita logistica. La popolazione di PC3-EMT continuò ad espandersi e PC3-Epi fu soppresso nella fase asintotica.
Le celle PC3-Epi e PC3-EMT erano densamente seduti al centro del dispositivo e gli era permesso di migrare liberamente verso l'area vuota. L'istogramma normalizzato della velocità di entrambi i fenotipi mostra che la velocità di PC3-EMT era significativamente superiore a PC3-Epi di un fattore di 1,8 volte. È molto importante evitare di creare microbolle a tutti i costi, mentre i mezzi di coltura dovrebbero essere preri riscaldati e de-gassati.
Il chip PDMS deve essere bagnato correttamente e maneggiato delicatamente. A causa della natura morbida e risigillabile del nostro metodo di tenuta della pressione, molti esperimenti a valle possono essere preformati. Come l'estrazione subclinica della popolazione, l'analisi dei metaboliti locali e l'immunofluorescenza e il sequenziamento risolti spazialmente.
La nostra tecnologia dimostra un modo per riprodurre componenti chiave e interazioni in un ambiente super-micro complesso in modo completo. Ma abbastanza semplice da fornire dati quantitativi, affidabili e riproducibili.
