Este modelo de câncer microfluido no chip, que chamamos de acelerador de evolução, fornece uma plataforma controlável para estudos quantitativos de longo prazo e em tempo real da dinâmica do câncer dentro de condições ambientais bem definidas em um único nível celular. A tecnologia nos permite sondar a dinâmica evolutiva do câncer sob uma paisagem de estresse semelhante a um tumor. Fornecendo informações incluindo morfologia, população, motilidade e migração ao longo do tempo no nível celular.
Com a capacidade de controlar e monitorar o comportamento das populações de tumores mistos sob gradientes de estresse bem controlados, nossa tecnologia pode apresentar um modelo mais fisiologicamente relevante para o desenvolvimento de medicamentos pré-clínicos. O método de embalagem de vedação de pressão apresentado também pode ser implementado em outros sistemas microfluidos que exigem ajuste sofisticado da composição do gás ambiente, bem como a capacidade de experimento a jusante. As chaves para realizar com sucesso um experimento de longo prazo é garantir um ambiente fisicamente e bioquimicamente estável.
Fatores como temperatura, umidade e composição do gás devem ser monitorados o tempo todo. Para começar, forja um porta-placas suficiente para conter pratos simultâneos de cultura permeável a gás em uma máquina de impressão 3D. Desaparafusar os componentes da placa de três poços personalizada com a chave de fenda.
Desinfete os componentes via exposição UV por pelo menos uma hora e deixe em um ambiente estéril. Para iniciar a semeadura da linha celular adicione cinco mililitros de trippsina em cada cultura de células PC3-Epi ou PC3-EMT em um prato de cultura de 10 centímetros e execute a trippsinização por cinco minutos em uma incubadora a 37 graus celsius. Transfira as células dos pratos da cultura em tubos de centrífugas de 15 mililitros e, em seguida, centrífuga a 150 vezes g por três minutos.
Descarte o supernaspeso. Suspenda-se de forma re-suspender cada uma das pelotas celulares nos tubos de centrífugas de 15 mililitros e contar as células de cada PC3-MP ou PC3-EMT usando um hemócito. Isole um total de 2,5 vezes 10 para os quatro de cada tipo de célula.
Misture os dois tipos de células isoladas e adicione dois mililitros de mídia cultural. Semente dois mililitros da cultura celular em cada um dos três pratos de cultura permeável a gás. Deixe o gás permeável na incubadora a 37 graus celsius durante a noite para as células se prenderem.
Desinfete os dispositivos PDMS via exposição UV por pelo menos uma hora e deixe em um ambiente estéril. Agora configure um sistema de fornecimento de gás que consiste em unidades de controle de dióxido de carbono e oxigênio, uma bomba de gás, uma câmara de mistura de gás, um umidificador ou bolha, e três conjuntos separados de válvulas de gás, e medidores de pressão. Alternativamente, use um sistema de fornecimento de gás que forneça condição de normoxia.
Certifique-se de que a umidade relativa da umidade na câmara de mistura seja aumentada para acima de 85%, Configure uma unidade de controle térmico de incubação no palco a 37 graus celsius com subsuperas de aquecimento separadas para a tampa e a placa inferior. No dia seguinte, retire os pratos de cultura permeáveis a gás da incubadora e identifique que os componentes detalhados estão em ordem, todo poço possui um porta-pratos de cultura permeável a gás, um suporte de chip PDMS, um suporte de janela de vidro e um par de janelas de vidro de 35 mililitros. Use os parafusos instalados para montar esses componentes e fixar o prato de cultura permeável do gás.
Em seguida, transfira o meio de cultura pré-aquecido para uma câmara de vácuo para desausarar por 20 minutos. Trate o chip PDMS em um sistema de plasma de oxigênio por 30 segundos, a fim de manter a hidrofilialidade. Em seguida, carregue duas seringas lentamente com 10 mililitros de mídia de crescimento desagasada e as outras duas seringas com 10 mililitros de reagente desejado de interesse.
Por exemplo, mídia e mídia com drogas. Conecte cada seringa individual a uma tubulação de 50 centímetros por uma agulha de distribuição de calibre 23 em um pino de aço oco. Insira um pino de aço oco na outra extremidade da tubulação.
Empurre a mídia para dentro da tubulação para preparar a tubulação e insira o pino de aço em cada chip PDMS através da camada de tampa. Encha a camada do reservatório e molhe a camada de padrão PDMS com mídia. A camada do reservatório funciona como armadilha de bolhas no chip para evitar que bolhas de ar entrem no padrão microfluido.
Em seguida, carregue uma seringa de um mililitro com mídia cultural. Conecte a seringa a uma tubulação de cinco centímetros por uma agulha de distribuição de calibre 23 em um pino de aço oco. Insira um pino de aço oco na outra extremidade da tubulação e prime o tubo.
Insira o pino de aço oco no orifício central do chip para que a mídia excessiva seja extraída posteriormente. Carregue duas seringas de 10 mililitros por chip no convés dianteiro e coloque as outras duas seringas no convés de retirada do sistema de seringas. Para evitar a entrada de microbolhas no padrão microfluido, dispense um mililitro da mídia pré-aquecida e desomusada no prato de cultura permeável de gás profundo de 35 mililitros.
Posicione os chips diretamente em cima das membranas de cultura permeáveis do gás, onde o chip se aproxima da superfície líquida com um ângulo de inclinação de 15 graus. Aperte o chip PDMS com o suporte do chip PDMS, empurrando o dispositivo PDMS para baixo. Ensuma uma folha de um selador em cima do dispositivo PDMS e aperte o grampo com o suporte do chip PDMS, a fim de evitar que o chip seque.
Defina a taxa de fluxo de mídia ao redor da matriz para 20 microliters por hora. Posicione toda a placa na incubadora do palco no estágio motorizado de um microscópio invertido. Conecte o sistema de fornecimento de gás aos canais de gás através da tubulação de gás e mantenha a pressão do medidor em 0,2 PSI.
Isso pressuriza a membrana de cultura permeável a gás contra o chip PDMS instalado para garantir a vedação do dispositivo. Extrair lentamente o excesso de mídia no chip usando a seringa de um mililitro do orifício central. Observe o chip sob o microscópio enquanto extrai mídia e, em seguida, pare de extrair quando o chip estiver selado.
Conecte a unidade de sensoriamento de temperatura da incubadora do palco à placa de três poços e estafina para 37 graus celsius. Neste estudo, o PC3 cultivado em um acelerador de evolução sem a presença de estresse externo teve curvas de crescimento enquanto alinhado. Sugerindo a idênticaidade do perfil de proliferação celular em função da posição através do chip.
A inclinação inicial das curvas revela a taxa de proliferação. O tempo de duplicação das células no dispositivo é de cerca de 24 horas. GFP expressando PC3-EMT e mCherry expressando célula PC3-Epi forrada foram co-cultivados no acelerador de evolução.
A partir de 40% de confluência, a cocultura cresceu 40% em três dias. Enquanto a curva de crescimento da confluência total está na forma de modelo de crescimento logístico. A população de PC3-EMT continuou a se expandir e o PC3-Epi foi suprimido na fase assintomática.
As células PC3-Epi e PC3-EMT estavam densamente sentadas no centro do dispositivo e foram autorizadas a migrar livremente para a região vazia. O histograma normalizado da velocidade de ambos os fenótipos mostra que a velocidade do PC3-EMT foi significativamente maior que o PC3-Epi por um fator de 1,8 vezes. É muito importante evitar criar microbolhas a todo custo, enquanto a mídia cultural deve ser pré-aquecida e desagasada.
O chip PDMS deve ser molhado corretamente e manuseado suavemente. Devido à natureza suave re-vedação do nosso método de vedação de pressão muitos experimentos a jusante podem ser pré-formados. Como extração populacional subclínica, análise metabólica local e imunofluorescência e sequenciamento espacialmente resolvidos.
Nossa tecnologia demonstra uma maneira de reproduzir componentes e interações-chave em um ambiente super-micro complexo de forma abrangente. No entanto, simples o suficiente para fornecer dados quantitativos, confiáveis e reprodutíveis.
