Ce modèle microfluidique de cancer sur puce, que nous appelons l’accélérateur d’évolution, fournit une plate-forme contrôlable pour les études quantitatives à long terme en temps réel de la dynamique du cancer dans des conditions environnementales bien définies à un seul niveau cellulaire. La technologie nous permet de sonder la dynamique évolutive du cancer dans un paysage de stress tumoral. Fournir de l’information, y compris la morphologie, la population, la motilité et la migration au fil du temps au niveau cellulaire.
Avec la capacité de contrôler et de surveiller le comportement des populations mixtes de tumeurs sous des gradients de stress bien contrôlés notre technologie peut présenter un modèle plus physiologiquement pertinent pour le développement de médicaments précliniques. La méthode d’emballage d’étanchéité sous pression présentée peut également être mise en œuvre dans d’autres systèmes microfluidiques qui nécessitent un ajustement sophistiqué de la composition du gaz ambiant ainsi que de la capacité d’expérimentation en aval. Les clés pour mener à bien une expérience à long terme est de sécuriser un environnement physiquement et biochimiquement stable.
Les facteurs, y compris la température, l’humidité et la composition du gaz, doivent être surveillés en tout temps. Pour commencer, fabriquez un porte-plaques qui est suffisant pour contenir simultanément des plats de culture perméables au gaz sur une machine d’impression 3D. Dévissez les composants de la plaque d’échantillon de trois puits personnalisée avec le conducteur de vis.
Désinfecter les composants par exposition aux UV pendant au moins une heure et laisser dans un environnement stérile. Pour commencer l’ensemencement des lignées cellulaires ajouter cinq millilitres de trypsine dans chaque culture cellulaire PC3-Epi ou PC3-EMT dans un plat de culture de 10 centimètres et exécuter la trypsinisation pendant cinq minutes dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Transférer les cellules des plats de culture dans des tubes de centrifugeuse de 15 millilitres, puis centrifugeuses à 150 fois g pendant trois minutes.
Jeter le surnatant. Suspendez chacune des granulés cellulaires dans les tubes de centrifugeuse de 15 millilitres et comptez les cellules de chaque PC3-MP ou PC3-EMT à l’aide d’un hémocytomètre. Isoler un total de 2,5 fois 10 à quatre de chaque type de cellule.
Mélanger les deux types de cellules isolées et ajouter deux millilitres de médias culturels. Ensemencer deux millilitres de la culture cellulaire dans chacun des trois plats de culture perméables au gaz. Laissez le gaz perméable dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant la nuit pour que les cellules s’attachent.
Désinfectez les appareils PDMS par exposition aux UV pendant au moins une heure et partez dans un environnement stérile. Maintenant, mettre en place un système d’approvisionnement en gaz qui se compose à la fois de dioxyde de carbone et d’unités de contrôle de l’oxygène, une pompe à gaz, une chambre de mélange de gaz, un humidificateur ou bubbler, et trois ensembles distincts de vannes de gaz, et des jauges de pression. Utilisez alternativement un système d’approvisionnement en gaz qui fournit l’état de normoxie.
Assurez-vous que l’humidité relative dans la chambre de mélange est augmentée à plus de 85 % Installez une unité de contrôle thermique d’incubation sur scène à 37 degrés Celsius avec des sous-unités de chauffage séparées pour le couvercle et la plaque inférieure. Le lendemain, sortez les plats de culture perméables au gaz de l’incubateur et d’identifier que les composants détaillés sont en ordre, Chaque puits possède un support de plat de culture perméable au gaz, un porte-puce PDMS, un porte-fenêtres en verre, et une paire de fenêtres en verre de 35 millilitres de large. Utilisez les vis ajustées pour assembler ces composants et serrer le plat de culture perméable au gaz.
Transférer ensuite le milieu de culture préchauffé dans une chambre à vide pour le dé-gazer pendant 20 minutes. Traitez la puce PDMS dans un système plasmatique à oxygène pendant 30 secondes afin de maintenir l’hydrophilie. Chargez ensuite deux seringues lentement avec 10 millilitres de supports de croissance dé-gazés et les deux autres seringues avec 10 millilitres de réapprovisionnement désiré dé-gazé d’intérêt.
Par exemple, les médias et les médias avec de la drogue. Connectez chaque seringue individuelle à un tube de 50 centimètres par une aiguille de distribution de calibre 23 dans une goupille en acier creux. Insérez une goupille en acier creux à l’autre extrémité du tube.
Poussez le média dans le tube pour amorcez le tube et insérez la goupille en acier dans chaque puce PDMS à travers la couche de plafonnement. Remplissez la couche du réservoir et mouillez la couche de motif PDMS avec du supports. La couche du réservoir fonctionne comme piège à bulles sur puce pour empêcher les bulles d’air d’entrer dans le modèle microfluidique.
Chargez ensuite une seringue d’un millilitre avec des supports culturels. Connectez la seringue à un tube de cinq centimètres par une aiguille de distribution de calibre 23 dans une goupille en acier creux. Insérez une goupille en acier creux à l’autre extrémité du tube et amorcez le tube.
Insérez la goupille en acier creux dans le trou central de la puce pour extraire plus tard les supports excessifs. Chargez deux seringues de 10 millilitres par puce dans le pont avant et placez les deux autres seringues dans le pont de retrait du système de seringue. Afin d’éviter d’enrôler les microbubbles dans le modèle microfluidique, distribuez un millilitre des médias préchauffés et dé-gazés dans le plat de culture perméable au gaz profond de 35 millilitres.
Placez les copeaux directement sur les membranes de culture perméables au gaz, où la puce s’approche de la surface liquide avec un angle d’inclinaison de 15 degrés. Serrez la puce PDMS avec le porte-puce PDMS, poussant l’appareil PDMS vers le bas. Collez une feuille d’un scellant sur le dessus de l’appareil PDMS et pincez avec le support de puce PDMS, afin d’empêcher la puce de sécher.
Réglez le débit des médias autour du tableau à 20 microlitres par heure. Placez toute la plaque dans l’incubateur sur scène sur la scène motorisée d’un microscope inversé. Connectez le système d’approvisionnement en gaz aux canaux de gaz par tube à gaz et maintenez la pression de la jauge à 0,2 PSI.
Ceci pressurise la membrane de culture perméable de gaz contre la puce installée de PDMS pour assurer l’étanchéité de l’appareil. Extraire lentement les supports excessifs de la puce à l’aide de la seringue d’un millilitre du trou central. Observez la puce au microscope tout en extrayant les supports, puis arrêtez d’extraire lorsque la puce est scellée.
Connectez l’unité de détection de température de l’incubateur sur scène à la plaque de trois puits et réglez à 37 degrés Celsius. Dans cette étude PC3 cultivé dans un accélérateur d’évolution sans la présence de stress externe avait des courbes de croissance tout alignés. Suggérant l’identique du profil de prolifération cellulaire en fonction de la position à travers la puce.
La pente initiale des courbes révèle le taux de prolifération. Le temps de doublement pour les cellules de l’appareil est d’environ 24 heures. GFP exprimant PC3-EMT et mCherry exprimant PC3-Epi cellule doublée ont été co-cultivés dans l’accélérateur d’évolution.
À partir de 40%confluence la coculture a augmenté de 40% confluent en trois jours. Alors que la courbe de croissance de la confluence totale est sous la forme d’un modèle de croissance logistique. La population de PC3-EMT a continué à augmenter et PC3-Epi a été supprimé dans la phase asymptotique.
Les cellules PC3-Epi et PC3-EMT étaient densément assises au centre de l’appareil et ont été autorisées à migrer librement vers la région vide. L’histogramme normalisé de la vitesse des deux phénotypes montre que la vitesse du PC3-EMT était significativement plus élevée que pc3-Epi par un facteur de 1,8 fois. Il est très important d’éviter de créer des microbobouillages à tout prix alors que les médias culturels doivent être préchauffés et dé-gazés.
La puce PDMS doit être mouillée correctement et manipulée délicatement. En raison de la nature rescellable douce de notre méthode d’étanchéité de pression beaucoup d’expériences en aval peuvent être préformées. Tels que l’extraction subclinique de population, l’analyse locale de métabolite, et l’immunofluorescence et le séquençage spatialement résolus.
Notre technologie démontre un moyen de reproduire les composants clés et les interactions dans un environnement super-micro complexe d’une manière globale. Pourtant, assez simple pour fournir des données quantitatives, fiables et reproductibles.
