这种微流体癌片上模型，我们称之为进化加速器，为在单细胞水平上在定义良好的环境条件下对癌症动力学进行长期、实时定量研究提供了一个可控的平台。该技术使我们能够在肿瘤样应力地貌下探索癌症的进化动力学。在细胞水平上提供包括形态、种群、运动和迁移的信息。
凭借在良好控制压力梯度下控制和监测混合肿瘤群体行为的能力，我们的技术可能为临床前药物开发提供一个更生理相关的模型。提出的压力密封包装方法也可以用于其他需要复杂调整环境气体成分和下游实验能力的微流体系统。成功进行长期实验的关键是确保物理和生化稳定的环境。
应时刻监控温度、湿度和气体成分等因素。首先，制造一个板架，足以在 3D 打印机上同时容纳气体渗透培养皿。用螺丝刀拧下定制的三个井样品板的部件。
通过紫外线照射对部件进行消毒至少一小时，并在无菌环境中离开。开始细胞系播种，在10厘米培养皿中，将5毫升的尝试素添加到每个PC3-Epi或PC3-EMT细胞培养中，并在37摄氏度的培养箱中运行5分钟的尝试素化。将培养皿中的细胞转移到15毫升离心管中，然后以150倍g离心3分钟。
丢弃上一杯。使用血细胞计重新悬浮15毫升离心管中的每个细胞颗粒，并计算每个PC3-MP或PC3-EMT的细胞。将每个单元格类型的四个单元格类型总共隔离 2.5 倍 10。
混合两种隔离细胞类型，并加入两毫升培养培养。将细胞培养的两毫升种子放入三种气体渗透培养皿中。将气体在97摄氏度的培养箱中保持渗透，使细胞附着。
通过紫外线照射对 PDMS 设备进行消毒至少一小时，并在无菌环境中离开。现在建立一个气体供应系统，包括二氧化碳和氧气控制单元、气体泵、气体混合室、加湿器或气泡器，以及三套独立的气体阀门和压力表。或者使用提供无氧条件的供气系统。
确保混合室的相对湿度增加到 85% 以上，在 37 摄氏度下设置一个在 37 摄氏度的台式孵化热控制单元，为盖子和底板提供单独的加热子单元。第二天，从孵化器中取出气体渗透培养皿，确定详细的组件井内有一个气体渗透培养皿架、一个PDMS芯片架、一个玻璃窗架和一对35毫升宽的玻璃窗。使用安装的螺钉组装这些部件，并夹紧气体渗透培养皿。
然后将预热培养介质转移到真空室中，以脱气 20 分钟。在氧气等离子体系统中处理 PDMS 芯片 30 秒，以保持亲水性。接下来用10毫升的脱气生长培养剂缓慢加载两个注射器，另外两个注射器用10毫升的脱气所需试剂。
例如，媒体和媒体与药物。通过 23 表点胶针将每个单独的注射器连接到 50 厘米的管子中，并插入一个空心钢销。将空心钢销插入油管的另一端。
将介质推入管内以给油管上，并通过封盖层将钢销插入每个 PDMS 芯片中。填充储层层，用介质将 PDMS 型板层弄湿。储层层可用作片上气泡陷阱，以防止气泡进入微流体模式。
然后用培养培养剂加载一毫升注射器。将注射器连接到一个 5 厘米的管子上，用 23 个仪表点胶针将注射器连接到一个空心钢销中。将空心钢销插入管的另一端，然后为油管进行上热。
将空心钢销插入芯片的中心孔中，以在以后提取过多的介质。将每个芯片装载两个 10 毫升注射器，然后将另外两个注射器放在注射器系统的提取甲板上。为了避免在微流体图案中夹住微泡，将预加热和去气介质的一毫升分配到35毫升深气体渗透培养皿中。
将芯片直接放在气体渗透培养膜上，芯片以 15 度倾斜角接近液体表面。使用 PDMS 芯片支架夹紧 PDMS 芯片，将 PDMS 器件向下推。将一块密封板放在 PDMS 设备的顶部，并夹住 PDMS 芯片支架，以防止芯片干燥。
将阵列周围的媒体流速设置为每小时 20 微升。将整个板放在倒置显微镜的电动舞台上的台式培养箱中。通过气管将供气系统连接到气体通道，并保持表压力为 0.2 PSI。
这可对已安装的 PDMS 芯片进行气体渗透培养膜加压，以确保器件密封。使用中心孔中的一毫升注射器缓慢提取芯片中的过多介质。在提取介质时观察显微镜下的芯片，然后在芯片密封时停止提取。
将台式培养箱的温度感应单元连接到三个井板，并设置为 37 摄氏度。在这项研究中，PC3在进化加速器中培养，没有外部应力，在对齐时有生长曲线。表明细胞增殖轮廓作为整个芯片位置的函数的相同性。
曲线的初始斜率显示了增殖率。设备中细胞的翻倍时间约为 24 小时。在进化加速器中，表达PC3-EMT和mCherry表达PC3-Epi细胞衬里的GPC是共同培养的。
从40%的汇合开始，共培养在三天内增长40%。。而总汇合的增长曲线是物流增长模型的形式。PC3-EMT的种群继续扩大，PC3-Epi在无症状阶段受到抑制。
PC3-Epi 和 PC3-EMT 电池密集地位于设备中心，允许自由迁移到空区域。两种表型速度的规范化直方图显示PC3-EMT速度明显高于PC3-Epi1.8倍。避免不惜一切代价制造微泡非常重要，而文化媒体应预先预热和去气化。
PDMS 芯片应正确湿润并轻柔处理。由于压力密封方法的软再密封性质，许多下游实验都可以预制。如亚临床种群提取、局部代谢物分析、空间解决免疫荧光和测序等。
我们的技术展示了一种在复杂的超微环境中全面重现关键组件和交互的方法。然而，它非常简单，能够提供定量、可靠和可重复的数据。
