בהשוואה לשיטות אחרות, פרוטוקול זה קל יותר לגלות אנטגוניסטרים חדשים, אגוניסטרים, אפנונים allosteric כמותית ואיכותית מבלי לדעת את מבנה דילול הידרו היווצרות של חלבון היעד. פרוטוקול זה יעיל מאוד, קל לטיפול, חסכוני וזמין מסחרית. שלב שיטת סינון תפוקה גבוהה זו עם ניתוח ITC, פפטידים קטנים פונקציונליים ניתן להשיג כמותית ואיכותית.
הדגמת ההליך תהיה יינג זאו וצ'יאנג וואנג, סטודנטים לתואר שני מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל בהליך זה, להכין פתרון של FGFR2 במאגר ציפוי בריכוז של 10 מיקרוגרם למיליליטר. מוסיפים מיליליטר אחד של הפתרון לצלחת של 35 ס"מ רבועים ומסתחררים שוב ושוב עד שהמשטח רטוב לחלוטין.
דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס עם רעידות. למחרת, יוצקים את פתרון הציפוי ומוסיפים את פתרון החסימה המוכן. דגירה בארבע מעלות צלזיוס לפחות שעה אחת, ואז להשליך את פתרון החסימה במהירות לשטוף את הצלחת שש פעמים עם TBST תוך הקפדה על המנה לא להתייבש.
יש לייחס מחדש את ספריית הפאג' המקורית במיליליטר אחד של TBST ולהוסיף זאת לצלחת הצפויה. בעדינות לטלטל את הצלחת על שייקר בטמפרטורת החדר במשך שעתיים. לאחר מכן, להשליך את supernatant ולשטוף את המנה 10 פעמים עם TBST.
אלוט פאג' כרוך על ידי הוספת מיליליטר אחד של 0.2 גליצין HCL טוחן לצלחת נדנדה בעדינות בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. מעבירים את האלונט לצינור מיקרוצנטריפוגה מעקר ומנטרלים אותו עם 100 מיקרוליטרים של טריס-HCL טוחנת אחת ב-pH 9.1. ראשית, לפני המלחמה את צלחות LB ו- IPTG X-Gal המוכנות ב 37 מעלות צלזיוס לפחות שעה לפני השימוש.
באמצעות טיפים pipette עם מחסניות מסנן, להכין 100 microliters של דילול פי עשרה של eluent ב LB. לאחר שתרבות ה- E.coli המוכנה מגיעה לשלב אמצע הרישום, מחלקים 200 מיקרוליטרים של התרבות לצינורות מיקרוצנטריפוגה מעוקרים אחד עבור כל דילול אלוני. כדי ליזום את הזיהום, להוסיף 50 microliters של כל דילול לצינורות המכילים את תרבות E.coli. מערבולת במהירות דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.
לאחר מכן השתמש מקלות ציפוי כדי לצפות את צלחות LB ו IPTG X-GAL עם 90 microliters של תערובת זו. לאחר חמש דקות, להפוך את הצלחות קטורת אותם לילה ב 37 מעלות צלזיוס. לספור לוחות כאשר הם מופיעים.
כדי להתחיל, לדלל את תרבות הלילה ב 20 מיליליטר של LB בבקבוק ארלנפייר 250 מיליליטר. מוסיפים את הדגירה הבלתי מועשרת והדגירה ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול נמרץ במשך 4-1/2 שעות. לאחר מכן, צנטריפוגה התרבות ב 12, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
מעבירים את העל-טבעי לצינור טרי. צנטריפוגה שוב באמצעות אותם תנאים להשליך את גלולה. מעבירים את ה-80% העליונים של העל-טבעי לצינור טרי ומוסיפים אותו לנפח 1/6 של 20% פוליאתילן גליקול ו-2.5 נתרן כלורי טוחן.
אפשרו לפואג' לזרז בן לילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, צנטריפוגה פאג' זירז ב 12, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. השלך שוב את העל-טבעי והצנטריפוגה באותם תנאים.
השתמש פיפטה כדי להסיר את שאריות על טבעי. תעבירו את גלולת הכדור במיליליטר אחד של TBS והעברו את העל-טבעי לצינור מיקרוצנטריפוגה. צנטריפוגה ב 12, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
מעבירים את העל-טבעי לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי ומזרזים שוב על-ידי הוספת נפח 1/6 של 20% פוליאתילן גליקול ו-2.5 נתרן כלורי טוחנת. דגירה על קרח במשך 15 עד 60 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 12, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
השלך שוב את העל-טבעי והצנטריפוגה באותם תנאים. השתמש פיפטה כדי להסיר את שאריות על טבעי. תן את גלולה ב 200 microliters של TBS ו צנטריפוגה לדקה נוספת כדי להסיר זיהומים.
לאחר מכן מעבירים את העל-טבעי לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי כדי להשיג את האלונט המוגבר. במחקר זה, מספר קלט הפאג' נשמר ללא שינוי ואילו ריכוז הציפוי של חלבון FGFR2 מצטמצם בהדרגה. תוצאות טיטר הפאג' מצביעות על כך שמספר הפאג'ים המתאוששים עולה בהדרגה, ולאחר שלושה סיבובים, יש עלייה של פי 65 בהשוואה לזה של הסיבוב הראשון.
לאחר מכן נערך ניסוי ITC כדי למדוד את הזיקה של הפפטיד הקטן ל- FGFR2. התוצאות מצביעות על כך שלפפטיד SP1 יש זיקה גבוהה כלפי FGFR2. נתונים אלה מדגימים את היעילות של פרוטוקול המיון.
כדי לחקור את הפעילות הביולוגית של פפטיד SP1, בדיקה התפשטות fibroblast מבוצעת באמצעות ערכת CCK-8. BALB/C3T3 הם דגירה עם פפטיד SP1 בריכוזים שונים. התוצאות מראות כי פפטיד SP1 מדכא את הצמיחה של התאים.
יש להימנע מהזיהום על ידי פאג'ים פראיים כאן. הקפד להשתמש טיפים פיפטה עמידים בתרסיס. תוך כדי צמיחה על ידי קבלת הגברה פאג'.
הליך זה יכול לשמש גם בהקרנת פפטידים קטנים שנקשרים לפחמימות, תאי תרבות ורקמות. פפטידים אלה יכולים להיות הגברה נוספת על אבחון וממוקד
